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2
Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été réalisé à l’UMR 1289 TANDEM
(Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème, Métabolisme).
Je tiens à remercier les personnes qui ont accepté de participer au jury de ce travail :
G. Fonty (Microorganismes: génome et environnement, CNRS), P. Dabert (Gestion des
effuents d’élevage et des déchets municipaux, CEMAGREF) qui me font l’honneur d’être
rapporteurs et F. Garabetian (Environnements et Paléoenvironnements Océaniques, Université
de Bordeaux) et J.J. Goddon (Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement, INRA)
d’avoir accepté de participer à ce jury.
J’adresse mes remerciements à L. Fortun-Lamothe (Directeur de thèse), V. Monteils
(Co-directeur de thèse), T. Gidenne (animateur de l’axe nutrition et écosystèmes digestifs)
pour m’avoir fait confiance, encadré, soutenu et s’être investi au cours de ce projet. Je tiens à
remercier S. Combes et L. Cauquil pour leur investissement dans ce travail. Je remercie
également le directeur du laboratoire X. Fernandez. Je remercie S. Lek et la commission
scientifique de l’école doctorale SEVAB pour leur confiance témoignée lors de l’attribution
de la bourse MRT.
J’adresse mes remerciements à l’ensemble des personnes qui ont contribué à la
réalisation de ces travaux :
•
les membres du comité de pilotage pour le temps consacré et les discussions : E.
Forano (Unité de Microbiologie, INRA) et J. Hamelin (Laboratoire de Biotechnologie
de l'Environnement, INRA).
•
S. Dejean (Institut de Mathématiques de Toulouse, Université Paul Sabatier) pour son
aide sur la partie bioinformatique et biostatistique de ce travail.
•
le personnel de l’UMR qui m’a soutenu, s’est investi dans ce travail et pour la bonne
ambiance : P. Aymard, C. Bannelier, V. Bataille, Jacques De Dapper, Jean De Dapper,
C. Dufresne, R. Dufresne, B. Gabinaud, A. Lapanouse, H. Manse, C. Molette, B.
Santacruz, M. Segura, S. Seidlinger et V. Tartie.
•
le personnel de l’UMR que j’ai moins côtoyé pendant ces 3 ans. A. Auvergne, C.
Bayourthe, R. Babile, M. Bouillet Oudot, M.L. Chemit, Y. Farizon, F. Enjalbert, N.
3
Marty-Gasset, M.C. Nicot, C. Pautot, H. Remignon, A. Troegeler, Z. Vitezica et Z.
Whadi-moussa.
Enfin un grand remerciement aux personnes ayant séjournées au bureau E212 pour
l’ambiance et les discussions : M. Kimse, M. Martignon, S. Murr, A. Zened, E. Oliveira, J.
Garvanèse,
I. Wane, U.N. Tran, F. Nice, C. Assemat, V. Soulie, A. Akoutey. Merci
également aux (anciens) doctorants pour leur aide précieuse C. Julien, J.P. Marden, Y.
Magloire et L. Theron.
Enfin un grand merci à tous les amis, à la famille et à S. Lebas pour leur soutien
permanent.
4
1.
R.J. Michelland, V. Monteils, A. Zened, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, J. Hamelin,
L. Fortun-Lamothe 2009 Spatial and temporal dynamics of bacterial community in
the bovine digestive tract. Journal of applied microbiology (in press)
2.
R.J. Michelland, S. Combes, V. Monteils, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
2009 Molecular analysis of the bacterial community in the digestive tract of rabbit.
Anaerobe (in press)
3.
R.J. Michelland, S. Dejean, S. Combes, L. Fortun-Lamothe, L. Cauquil 2009
StatFingerprints: a friendly graphical interface program for processing and analysis
of microbial fingerprint profiles. Molecular ecology resources (in press)
4.
R.J. Michelland, S. Combes, V. Monteils, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
Comparison of the archaeal community in the fermentative compartments and feces
of the cow and the rabbit(in prep.)
5.
R.J. Michelland, V. Monteils, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe 2months dynamic of the rumen predominant bacterial divisions in response to a
nutritional disturbance (in prep.)
6.
R.J. Michelland, S. Combes, V. Monteils, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
Rapid adaptation of the bacterial community in the rabbit cæcum to a reduction of
dietary fiber supply (in prep.)
5
1.
R.J. Michelland, V. Monteils, A. Zened, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, L. FortunLamothe (2007) Caractérisation des communautés bactériennes dans le rumen et les
fecesde bovins adultes par PCR-SSCP. Colloque d'écologie microbienne, La Grande
Motte, France, pp.71.
2.
R.J. Michelland, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, V. Monteils, L. Fortun-Lamothe
(2007) Caractérisation comparée des communautés bactériennes du contenu cæcal,
des cæcotrophes et des feces dures chez le lapin adulte par CE-SSCP des gènes
codant pour l'ARN 16S. 12ème journée de la recherche cunicole, Le Mans, France,
pp.77-80.
3.
R.J. Michelland, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, V. Monteils, L. Fortun-Lamothe
(2008) Characterization of bacterial communities in cæcum, hard and soft feces of
rabbit using 16S rRNA genes capillary electrophoresis single-strand conformation
polymorphism (CE-SSCP) 9th world rabbit congress, Verona, Italy, pp.294.
4.
R.J. Michelland, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, V. Monteils, L. Fortun-Lamothe
(2008) Comparative study of archaeal community in the digestive ecosystem of the
rabbit and cow reveals strong host species and compartment effects Gut microbiome
6th INRA-RRI symposium, Clermont Ferrand, France, pp.50.
5.
R.J. Michelland, S. Combes, L. Cauquil, V. Monteils, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
(2007) Caractérisation comparée des communautés bactériennes du contenu cæcal,
des cæcotrophes et des faeces dures chez le lapin par PCR-SSCP. 2ème journée
d'animation scientifique du département de physiologie animale et système d'élevage de
l'INRA, Tours, France, pp.107.
6.
R.J. Michelland, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, V. Monteils, L. Fortun-Lamothe
(2009) Comparative study of the archaeal community in the digestive tract of the
6
rabbit and the cow reveals strong host species and compartment effects. Journée
scientifique de la SEVAB, Castanet Tolosan, France.
7.
R. J. Michelland, V. Monteils, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
(2009) Les archaea dans le tube digestif des herbivores domestiques : comparaison
vache / lapin. 2ème journée de la recherche de l’ENSAT, Castanet Tolosan, France.
8.
R.J. Michelland, S. Combes, V. Monteils, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
(2009, submitted) Adaptation rapide de la communauté bactérienne cæcale du lapin
à une réduction du taux de fibres alimentaires. 3ème journée d'animation scientifique
du département de physiologie animale et système d'élevage de l'INRA, Tours, France.
7
8
Remerciements................................................................................................................................... 3
Publications et communications issues de la thèse.......................................................................... 5
Publications scientifiques dans des revues à comité de lecture de rang A ...................................................... 5
Communications en congrès et journées d’animations ................................................................................... 6
Table des matières ............................................................................................................................. 9
Liste des tableaux............................................................................................................................. 15
Liste des figures................................................................................................................................ 17
Liste des abbréviations .................................................................................................................... 21
INTRODUCTION GENERALE .......................................................................................... 23
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 27
Chapitre 1 - Les fermenteurs digestifs chez les mammifères herbivores.................................... 29
I. Définition d’un fermenteur digestif ........................................................................................................... 29
II. Rôle physiologique et Evolution des fermenteurs digestifs...................................................................... 29
III. Tractus gastro-intestinal et fermenteurs digestifs des mammifères......................................................... 30
III.A. Particularités chez les carnivores et omnivores ................................................................................................. 31
III.B. Particularités chez les herbivores....................................................................................................................... 33
III.B.1. Petits herbivores: stratégie du fermenteur cæcal ........................................................................................ 33
III.B.2. Grands herbivores : stratégie du fermenteur colique .................................................................................. 33
III.B.3. Grands herbivores : stratégie du fermenteur stomacal................................................................................ 35
IV. Approche comparative : le choix des modèles « vache » et « lapin »..................................................... 35
V. Le modèle vache ...................................................................................................................................... 35
V.A. Le fermenteur majeur : le réticulo-rumen........................................................................................................... 35
V.A.1. Anatomie..................................................................................................................................................... 35
V.A.2. Stratification du contenu réticulo-ruminal................................................................................................... 37
V.A.3. Transit du bol alimentaire dans le réticulo-rumen et rumination................................................................. 37
V.A.4. Absorption dans l’omasum.......................................................................................................................... 38
V.A.5. Dégradation des micro-organismes dans l’abomasum ................................................................................ 38
V.B. Les fermentateurs mineurs : le côlon et le cæcum .............................................................................................. 38
VI. Le modele lapin ...................................................................................................................................... 39
VI.A. Dégradation du bol alimentaire avant le cæcum................................................................................................ 39
VI.B. Anatomie du cæcum.......................................................................................................................................... 40
VI.C. Anatomie du côlon ............................................................................................................................................ 41
VI.D. Cæcotrophie ...................................................................................................................................................... 42
VI.E. Cæcotrophes et crottes dures ............................................................................................................................. 43
VII. Comparaison des fermenteurs digestifs de la vache et du lapin............................................................. 45
Chapitre 2 - écologie comparée des fermenteurs digestifs ........................................................... 47
I. Le microbiote............................................................................................................................................. 47
I.A. Généralité............................................................................................................................................................. 47
I.B. Les bactéries......................................................................................................................................................... 49
I.B.1. Une forte proportion de bactéries.................................................................................................................. 50
I.B.2. Une faible diversité au sein des grandes divisons taxonomiques .................................................................. 50
I.B.3. Une forte diversité au niveau spécifique et intra-spécifique ......................................................................... 51
I.C. Les archaea.......................................................................................................................................................... 52
I.D. Les eucaryotes...................................................................................................................................................... 55
I.D.1. Les protozoaires............................................................................................................................................ 55
I.D.1.1. Les ciliés ........................................................................................................................................... 56
I.D.1.2. Les flagellés ...................................................................................................................................... 57
I.D.2. Les champignons .......................................................................................................................................... 57
I.D.2.1. Les Chytridiomycetes ....................................................................................................................... 57
I.D.2.2. Les Eurotiomycètes........................................................................................................................... 58
I.D.2.3. Les Saccharomycetes ........................................................................................................................ 58
I.E. Les entités biologiques ......................................................................................................................................... 58
9
I.F. Notion d’espèce chez les micro-organismes ......................................................................................................... 59
II. Le biotope................................................................................................................................................. 60
II.A. Importance des contraintes ecologiques ............................................................................................................. 60
II.B. Composition de l’intrant ..................................................................................................................................... 61
II.C. Paramètres physico-chimique du milieu ............................................................................................................. 63
III. Structuration de l’écosystème ................................................................................................................. 66
III.A. Evolution temporelle ......................................................................................................................................... 66
III.A.1. Mise en place de l’écosystème ................................................................................................................... 66
III.A.2. Climax et équilibre dynamique .................................................................................................................. 66
III.A.3. Réponse aux perturbations ......................................................................................................................... 67
III.B. Structuration spatiale ......................................................................................................................................... 68
IV. Métabolismes principaux ........................................................................................................................ 70
IV.A. Dégradation des polymères végétaux ................................................................................................................ 70
IV.A.1. Hydrolyse des polymères végétaux complexes.......................................................................................... 72
IV.A.2. Fermentation des oses simples................................................................................................................... 72
IV.A.3. Hdrogénotrophie ........................................................................................................................................ 74
IV.B. Dégradation de la lignine .................................................................................................................................. 75
IV.C. Dégradation des protéines ................................................................................................................................. 75
IV.D. Dégradation des lipides ..................................................................................................................................... 77
IV.D.1. Fermenteur en position antérieure : le cas de la vache............................................................................... 77
IV.D.2. Fermenteur en position postérieure : cas du lapin...................................................................................... 77
IV.E. Capacités métaboliques des principales espèces bactériennes ........................................................................... 78
V. Quelques facteurs de variabilité du microbiote ........................................................................................ 82
VI.A. Variabilité entre espèces Hotes ......................................................................................................................... 82
VI.B. Variabilité entre individus de la même espèce .................................................................................................. 82
VI.C. Perturbation alimentaire .................................................................................................................................... 83
Chapitre 3 - Méthode d’étude du microbiote des écosystèmes digestifs ..................................... 85
I. Collecte des échantillons ........................................................................................................................... 85
II. Mise en évidence du microbiote............................................................................................................... 86
II.A. Le choix du gène................................................................................................................................................. 86
II.A.1. Approche neutre .......................................................................................................................................... 86
II.A.2. Approche fonctionnelle ............................................................................................................................... 88
II.A.3. Approche métagénomique........................................................................................................................... 89
II.B. Les techniques de détection et de quantification des espèces microbiennes ....................................................... 89
II.B.1. L’hybridation moléculaire : les biopuces..................................................................................................... 89
II.B.2. Le séquençage ............................................................................................................................................. 90
II.B.2.1. Clonage et séquençage de Sanger .................................................................................................... 90
II.B.2.2. SARST............................................................................................................................................. 91
II.B.2.3. Le pyroséquençage .......................................................................................................................... 91
II.B.3. La PCR quantitative .................................................................................................................................... 93
II.B.3.1. Technologie SYBR Green ............................................................................................................... 93
II.B.3.2. Technologie TaqMan....................................................................................................................... 93
II.B.4. Les empreintes moléculaires........................................................................................................................ 95
II.B.5. La CE-SSCP ................................................................................................................................................ 97
II.B.5.1. Principe............................................................................................................................................ 97
II.B.5.2. L’information contenue dans les profils CE-SSCP.......................................................................... 99
II.B.5.3. Biais d’extraction et d’amplification PCR ..................................................................................... 100
II.B.5.4. Biais de co-migration..................................................................................................................... 101
Objectifs ................................................................................................................................ 105
ETUDE EXPERIMENTALE.............................................................................................. 109
Partie 1 : Traitement des données et Choix méthodologiques................................................... 111
Analyse des profils CE-SSCP........................................................................................................ 113
I. Traitement du signal .............................................................................................................................................. 113
II. Estimation de la diversité à l’aide d’indices ......................................................................................................... 115
II.A. Définition et limite des indices de diversité ................................................................................................. 116
II.B. Comparaison des indices de Shannon et de Simpson ................................................................................... 116
II.C. Prise en compte du bruit de fond des profils CE-SSCP ................................................................................ 118
II.D. Signification de l’indice de Simpson............................................................................................................ 119
II.D.1. Limite de l’indice de Simpson.......................................................................................................... 120
10
II.D.2. Influence de la richesse et de l’abondance sur l’indice de Simpson ................................................. 122
III. Analyse de la structure du profil CE-SSCP......................................................................................................... 124
III.A. Définition.................................................................................................................................................... 124
III.B. Indice de proximité ..................................................................................................................................... 124
III.C. Représentations graphiques......................................................................................................................... 125
III.C.1. Les ordinations ................................................................................................................................ 126
III.C.2. le regroupement hiérarchique .......................................................................................................... 126
III.D. Test statistiques basés sur une hypothèse.................................................................................................... 126
StatFingerprints: un programme de traitement et d’analyse des profils microbiens issus
d’empreintes moléculaires ............................................................................................................ 129
StatFingerprints: a friendly graphical interface program for processing and analysis of
microbial fingerprint profiles ....................................................................................................... 131
1. Abstract ................................................................................................................................................... 133
2. Introduction............................................................................................................................................. 135
3. Import and export fingerprint profiles..................................................................................................... 137
4. Process fingerprint profiles ..................................................................................................................... 137
5. Estimation and analysis of diversity indexes .......................................................................................... 137
6. Analysis of the structure of community with multivariate statistics ....................................................... 138
7. Conclusion .............................................................................................................................................. 140
8. Acknowledgements ................................................................................................................................. 140
9. References............................................................................................................................................... 141
Partie 2 Variabilité spatiale, temporelle, inter-individuelle et inter-spécifique des
communautés procaryotiques....................................................................................................... 145
Variations spatiales et temporelles des communautés bactériennes dans le tractus digestif de la
vache laitière................................................................................................................................... 147
Spatial and temporal variations of the bacterial community in the bovine digestive tract .... 149
1. Abstract ................................................................................................................................................... 151
2. Introduction............................................................................................................................................. 153
3. Materials and methods ............................................................................................................................ 154
3.1. Experimental design........................................................................................................................................... 154
3.2. Determination of environmental parameters ...................................................................................................... 155
3.3. DNA extraction and PCR amplification............................................................................................................. 155
3.4. Capillary Electrophoresis Single-Stranded Conformation Polymorphism ......................................................... 155
3.5. Diversity index and structure of communities.................................................................................................... 156
3.6. Statistical analyses of environmental parameters and diversity index................................................................ 157
3.7. Statistical analyses of the structure of the bacterial communities....................................................................... 157
3.8. Relationships between bacterial communities and environmental parameters ................................................... 158
4. Results..................................................................................................................................................... 158
4.1. Environmental parameters of the ventral rumen ................................................................................................ 158
4.2. Effect of individual cow on bacterial communities ............................................................................................ 159
4.3. Comparison of the bacterial communities residing at different sites of the digestive tract................................. 160
4.4. Dynamics of bacterial communities between weeks and after meals ................................................................. 162
4.5. Relationship between environmental parameters and bacterial communities..................................................... 162
5. Discussion ............................................................................................................................................... 163
6. Acknowledgments................................................................................................................................... 166
7. References............................................................................................................................................... 167
Analyse moléculaire de la communauté bactérienne du tube digestif du lapin ....................... 171
Molecular analysis of the bacterial community in digestive tract of rabbit ............................. 173
1. Abstract ................................................................................................................................................... 175
2. Introduction............................................................................................................................................. 177
3. Materials and methods ............................................................................................................................ 178
3.1. Experimental design and sampling..................................................................................................................... 178
3.2. Determination of environmental parameters ...................................................................................................... 178
3.3. DNA extraction, amplification and CE-SSCP.................................................................................................... 179
3.4. Diversity index and structure of communities.................................................................................................... 179
3.5. Statistical analysis .............................................................................................................................................. 180
4. Results..................................................................................................................................................... 181
4.1. The cæcal biotope .............................................................................................................................................. 182
11
4.2. Bacterial communities in cæcal content, soft and hard fæces............................................................................. 182
4.3. Individual effect on bacterial community........................................................................................................... 183
3.4. Stability over time and effect of surgery on bacterial communities ................................................................... 183
4.5. Relationships between bacterial community and environmental parameters in the cæcum ............................... 185
5. Discussion ............................................................................................................................................... 185
6. Conclusions............................................................................................................................................. 186
7. Acknowledgments................................................................................................................................... 187
8. References............................................................................................................................................... 188
Comparaison des communautés d’Archaea dans les fermenteurs digestifs et les fèces de la
vache et du lapin ............................................................................................................................ 191
Comparison of the archaeal community in the fermentative compartment and faeces of the
cow and the rabbit ......................................................................................................................... 193
1. Abstract ................................................................................................................................................... 195
2. Introduction............................................................................................................................................. 197
3. Materials and methods ............................................................................................................................ 198
3.1. Experimental design........................................................................................................................................... 198
3.2. DNA extraction, PCR and CE-SSCP ................................................................................................................. 198
3.3. CE-SSCP profile processing .............................................................................................................................. 199
3.4. Data analysis ...................................................................................................................................................... 200
4. Results..................................................................................................................................................... 201
4.1. Representativeness of the archaeal community of soft faeces to analyse the cæcal content............................... 201
4.2. Host species’ effect ............................................................................................................................................ 202
4.3. Archaeal community of the cow ........................................................................................................................ 203
4.4. Archaeal community of the rabbit...................................................................................................................... 204
5. Discussion ............................................................................................................................................... 205
6. Conclusion .............................................................................................................................................. 208
7. Acknowledgements ................................................................................................................................. 208
8. References............................................................................................................................................... 209
Partie 3 : Caractérisation de la réponse des communautés bactériennes à une perturbation
nutritionnelle permanente : effet d’une augmentation du ratio amidon/fibres ....................... 215
Suivi dynamique sur 2 mois de l’évolution des populations bactériennes dominantes dans le
rumen en réponse à une perturbation nutritionnelle ................................................................. 217
2-months dynamic of the rumen predominant bacterial divisions in response to a nutritional
disturbance ..................................................................................................................................... 219
1. Abstract ................................................................................................................................................... 221
2. Introduction............................................................................................................................................. 223
3. Materials and methods ............................................................................................................................ 224
3.1. Experimental design........................................................................................................................................... 224
3.2. Sampling, measurement and determination of environmental parameters ......................................................... 224
3.3. DNA extraction .................................................................................................................................................. 225
3.4. 16S rRNA gene PCR-CE-SSCP......................................................................................................................... 225
3.5. Analysis of bacterial community........................................................................................................................ 226
3.6. Real time qPCR.................................................................................................................................................. 226
3.7. Statistical analysis .............................................................................................................................................. 229
4. Results..................................................................................................................................................... 230
4.1. Environmental parameters.................................................................................................................................. 230
4.2. Quantification of 16S rDNA copies number ...................................................................................................... 234
4.3. Bacterial diversity index..................................................................................................................................... 234
4.4. Structure of the bacterial community ................................................................................................................. 234
4.5. Correlation between the microbiota and the environmental parameters............................................................. 237
5. Discussion ............................................................................................................................................... 238
5.1. Environmental parameters.................................................................................................................................. 238
5.2. Effect of the nutritional disturbance on the bacterial community....................................................................... 239
5.3. Dynamic of the bacterial community ................................................................................................................. 240
5.4. Bacterial community in the solid and liquid fraction of the rumen content........................................................ 241
5.5. Correlation between the bacterial community and the rumen environment ....................................................... 241
6. Conclusion .............................................................................................................................................. 242
7. Acknowledgments................................................................................................................................... 242
8. References............................................................................................................................................... 243
12
Adaptation rapide de la communauté bactérienne du cæcum de lapin en réponse à une
réduction des apports en fibres alimentaires .............................................................................. 251
Rapid adaptation of the bacterial community in the rabbit cæcum to a reduction of dietary
fiber supply..................................................................................................................................... 253
1. Abstract ................................................................................................................................................... 255
2. Introduction............................................................................................................................................. 257
3. Material and methods.............................................................................................................................. 258
3.1. Experimental design........................................................................................................................................... 258
3.2. Sampling, measurement and determination of environmental parameters ......................................................... 258
3.3. DNA extraction .................................................................................................................................................. 259
3.4. 16S rRNA gene PCR-CE-SSCP......................................................................................................................... 259
3.5. Real time qPCR.................................................................................................................................................. 259
3.6. Statistical analysis .............................................................................................................................................. 262
4. Results..................................................................................................................................................... 262
4.1. Effect of nutrient disturbance on environmental parameters .............................................................................. 264
4.2 Effect of the nutrient disturbance on Quantification of 16S rDNA copies number ............................................. 264
4.3. Effect of the nutrient disturbance on the bacterial diversity ............................................................................... 264
4.4. Effect of the nutrient disturbance on the structure of the bacterial community .................................................. 266
4.5. Correlation between bacterial group concentrations and environmental parameters.......................................... 266
4.6. Correlation between the structure of the bacterial community and the environmental parameters .................... 267
5. Discussion ............................................................................................................................................... 268
5.1. Nutrient effect on the bacterial community........................................................................................................ 269
5.2. Nutrient effect on the cæcal parameters ............................................................................................................. 269
5.3. Dynamic of bacterial community in the rabbit cæcum....................................................................................... 270
5.4. Correlation between the bacterial community and the cæcal environment ........................................................ 270
6. Conclusion .............................................................................................................................................. 271
7. Acknowledgments................................................................................................................................... 271
8. References............................................................................................................................................... 272
Discussion générale .............................................................................................................. 277
1. Analyse critique de la méthodologie....................................................................................................... 280
1.A. La technique CE-SSCP ..................................................................................................................................... 280
1.A.1. Atouts et limites ......................................................................................................................................... 280
1.A.2. Traitement du signal .................................................................................................................................. 282
1.A.3. Estimation de la diversité........................................................................................................................... 283
1.A.4. Analyse de la structure des communautés microbiennes ........................................................................... 283
1.B. La qPCR ............................................................................................................................................................ 285
1.B.1. Choix des divisions bactériennes étudiées.................................................................................................. 285
1.B.2. La qualité des amorces PCR....................................................................................................................... 285
2. Comparaison des communautés procaryotiques chez la vache et le lapin .............................................. 286
2.A. Intérêt et objectifs de l’approche comparée ....................................................................................................... 286
2.B. Comparaison des communautés procaryotiques chez les deux espèces............................................................. 287
2.C. Variabilité interindividuelle des communautés procaryotiques au sein d’une même espèce ............................. 290
2.C.1. Cas des bactéries ........................................................................................................................................ 290
2.C.2. Cas des Archaea......................................................................................................................................... 292
2.D. Structuration spatiale des communautés procaryotiques ................................................................................... 293
2.D.1. Comparaison des différents fermenteurs au sein du tube digestif d’une même espèce .............................. 293
2.D.2. Variabilité entre fractions au sein du compartiment ventral du rumen....................................................... 297
2.E. évolutions temporelles ....................................................................................................................................... 299
2.E.1. Dynamique naturelle des communautés procaryotiques............................................................................. 299
2.E.2. Dynamique des communautés bactériennes suite à une perturbation ......................................................... 300
3. Les relations entre les communautés bactériennes et leur environnement .............................................. 303
Conclusions & Perspectives................................................................................................. 305
Références bibliographiques ............................................................................................... 311
Abstract .......................................................................................................................................... 359
Résumé............................................................................................................................................ 361
13
14
Tableau 1. Comparaison du tractus gastro-intestinal des mammifères. ................................................................ 32
Tableau 2. Comparaison du tractus gastro-intestinal des mammifères herbivores................................................ 34
Tableau 3. La dégradation des nutriments dans le tractus gastro-intestinal du lapin ............................................ 39
Tableau 4. Comparaison de la composition des crottes dures et des cæcotrophes du lapin .................................. 44
Tableau 5. Physiologie comparative de la vache et du lapin................................................................................. 45
Tableau 6. Groupes microbiens présents dans les fermenteurs digestifs des mammifères ................................... 47
Tableau 7. Paramètres physico-chimiques du rumen et du cæcum du lapin ......................................................... 64
Tableau 8. Composition des fermenteurs digestifs de la vache (rumen) et du lapin (cæcum) ainsi que de leur
feces : bouse pour la vache, crotte, cæcotrophe pour le lapin. .............................................................................. 65
Tableau 9. Les différentes divisions bactériennes présentes dans la phase liquide, solide et dans l’épithélium du
rumen. ................................................................................................................................................................... 69
Tableau 10. Les voies d’hydrogénotrophie ........................................................................................................... 74
Tableau 11. Fonctions in vitro des bactéries cultivables isolées du rumen. .......................................................... 79
Tableau 12. Comparaison des méthodes actuelles d'empreintes moléculaires pour étudier les écosystèmes
microbiens............................................................................................................................................................. 97
Tableau 13. Récapitulatif des différents travaux et expérimentations réalisés.................................................... 108
Tableau 14. Effects of individual animal, week, and hour after meal in the ventral rumen and effect of sampling
site on the structure of bacterial communities using ANOSIM........................................................................... 158
Tableau 15. Effects of individual animal, week, hour after meal and sampling site on diversity index of the
bacterial communities ......................................................................................................................................... 159
Tableau 16. Effects of environmental parameters on the structure of the bacterial community of the ventral
rumen 3 h after a meal using 50-50 F-test........................................................................................................... 162
Tableau 17. Correlations between environmental parameters and diversity index of the bacterial community of
the ventral rumen 3 h after a meal....................................................................................................................... 163
Tableau 18. Effect of individual and sampling week on the bacterial community of cæcum, soft and hard fæces
using global and pairwise ANOSIM statistical test............................................................................................. 182
Tableau 19. Effect of host species, sample type and sampling week on the structure of the archaeal community
............................................................................................................................................................................ 203
Tableau 20. PCR primers and probes used for qPCR assays .............................................................................. 228
Tableau 21. Effects of the nutritional disturbance on the environmental parameters of the rumen. ................... 230
Tableau 22. Effects of the nutritional disturbance and the ruminal fraction on the number of gene copies of total
Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and the bacterial diversity index. .......................................... 236
Tableau 23. PCR primers and probes used for qPCR assays .............................................................................. 261
Tableau 24. Effect of the diet on the cæcal environmental parameters, the number of gene copies of total
Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and the bacterial diversity index. .......................................... 263
15
16
Figure 1. Anatomie générale du réticulo-rumen (A) et de l’épithélium ruminal (B) et réticulaire (C). ................ 37
Figure 2. Morphologie du cæcum du lapin. .......................................................................................................... 41
Figure 3. Représentation schématique du côlon du lapin...................................................................................... 42
Figure 4.Taxons microbiens mis en évidence dans les fermenteurs digestifs ....................................................... 48
Figure 5. Arbre phylogénétique des divisions bactériennes présentes dans le côlon humain au sein de toutes les
divisions bactériennes existantes........................................................................................................................... 50
Figure 6. Les principaux genres bactériens des fermenteurs digestifs: Bacteroides sp. (A), Clostridium sp. (B),
Fusobacterium sp. (C), Eubacterium sp. (D), Ruminococcus sp. (E), Peptostreptococcus sp. (F) et
Bifidobacterium sp. (G)......................................................................................................................................... 52
Figure 7. Les Archaea présentes dans les fermenteurs digestifs au sein de l’arbre phylogénétique des Archaea. 54
Figure 8. Cilié holotriche du genre Isotricha (couleur) associé avec des ciliés entodiniomorphes (gris), flagellés
(B), Chytridiomycetes ou champignon anaérobie sur soja (C), moisissures du genre Penicillium (D) et
Aspergillus (E), levure saccharomyces cerevisiae (F). ......................................................................................... 56
Figure 9. Fragilisation des polymères végétaux par un champignon. ................................................................... 58
Figure 10. Morphotypes viraux du rumen............................................................................................................. 59
Figure 11. Les différents composants du bol alimentaire entrant dans le fermenteur digestif des mammifères
herbivores.............................................................................................................................................................. 61
Figure 12. Méthode de dosage des fibres végétales et nature du résidu d’analyse................................................ 62
Figure 13. Principales voies métaboliques des glucides dans les fermenteurs digestifs. ...................................... 71
Figure 14. Dégradation des protéines dans les fermenteurs digestifs.................................................................... 76
Figure 15. Consortium bactérien de différentes espèces sur des fibres végétales (Krause et al., 2003) ............... 80
Figure 16. Principe de la biopuce.......................................................................................................................... 90
Figure 17. Principe du pyroséquençage 454. ........................................................................................................ 92
Figure 18. Principe de la qPCR en technologie SYBR Green (A) et Taqman (B)................................................ 95
Figure 19. Principe de la CE-SSCP....................................................................................................................... 98
Figure 20. Exemple de profil CE-SSCP................................................................................................................ 99
Figure 21. Simulation de profils CE-SSCP avec une distribution uniforme de l’abondance des espèces........... 102
Figure 22. Traitement des profils CE-SSCP. ...................................................................................................... 114
Figure 23. Analyse statistique de la structure et de la diversité d’une communauté à partir de profils d’empreintes
moléculaires. ....................................................................................................................................................... 115
Figure 24. Calcul de l’indice de Simpson par simulation de profils CE-SSCP selon des richesses et des
distributions de l’abondance des espèces variables............................................................................................. 118
Figure 25. Comparaison de la diversité de Simpson réelle et de celle estimée à partir de profils CE-SSCP simulés
en fonction de la prise en compte ou non du bruit de fond. ................................................................................ 119
Figure 26. Simulation de l’indice de diversité de Simpson en fonction de la richesse pour une abondance relative
constante. ............................................................................................................................................................ 121
Figure 27. Exemple de méthode classique pour analyser la structure des profils CE-SSCP............................... 127
Figure 28. Structure of the StatFingerprints program. ........................................................................................ 136
Figure 29. Analysis of CE-SSCP profiles of the Archaeal community of the digestive tract of the rabbit and the
cow using StatFingerprints.................................................................................................................................. 138
Figure 30. Scheme of the experimental design. .................................................................................................. 154
17
Figure 31. Two-dimensional nMDS plot of the 50 CE-SSCP profiles from the 1st (○), 2nd (●) and 3rd (●)
weeks. ................................................................................................................................................................. 160
Figure 32. Structure differences on average CE-SSCP profiles between two distinct bacterial communities:
forestomach vs fæces (A), 1st vs 2nd week (B) and 2nd vs 3rd week (C)........................................................... 161
Figure 33. Dynamics of the Simpson diversity index for cæcal content and soft and hard fæces. ..................... 181
Figure 34. Two-dimensional nMDS plot of the 158 CE-SSCP profiles set according to sample type and surgery.
............................................................................................................................................................................ 183
Figure 35. Structure differences of bacterial community between cæcal content, and soft and hard fæces before
surgery (A) and effect of surgery in bacterial community structure in cæcal content (B). ................................. 184
Figure 36. Richness index of the archaeal community according to fermentative compartment and faeces of cow
and rabbit. ........................................................................................................................................................... 201
Figure 37. Two-dimensional nMDS plot of cow and rabbit CE-SSCP profiles of the archaeal community. ..... 204
Figure 38. Localization archaeal in digestive tract of significant differences occurring along the CE-SSCP profile
between the fermentative compartment (A) and faeces (B) of the two host species, between the rumen and the
faeces of the cow (C), and between the soft and the hard faeces of the rabbit (D). ............................................ 205
Figure 39. Dynamics of the pH (A), the redox potential (B), the NH3-N (C) and the total VFAs (D)............... 232
Figure 40. Dynamics of the number of gene copies of Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and of the
bacterial diversity index in rumen liquid fraction (A, C, E and G respectively) and solid fraction (B, D, F, and H
respectively). ....................................................................................................................................................... 233
Figure 41. Effect of the ruminal fraction on the structure of the bacterial community. ...................................... 237
Figure 42. PCA plot of the seven environmental parameters, the diversity index and the number of gene copies
of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella before (∆) and after (▲) the nutritional disturbance. 238
Figure 43. Dynamics of the number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and
the bacterial diversity index in control (dashed line) and low-fiber diet rabbits (solid line)............................... 265
Figure 44. Effect of the diet on the structure of the bacterial community.......................................................... 266
Figure 45. PCA plot of the ten environmental parameters, the diversity index and the number of gene copies of
total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella assessed in the low-fiber diet (▲) and control (∆) rabbits.
............................................................................................................................................................................ 267
Figure 46. Variance partitioning with partial RDA of CE-SSCP data from control and low-fiber diet rabbits
according to the stepwise selected environmental parameters. ........................................................................... 268
Figure 47. Comparaison des communautés procaryotiques du rumen de la vache et du cæcum de lapin pour les
bactéries et les Archaea en terme de richesse (A), de diversité de Simpson (B) et de densités de Bactéries, de
Firmicutes et de Bacteroides Prevotella (C)....................................................................................................... 287
Figure 48. Comparaison des profils CE-SSCP moyens du rumen de la vache (A) et du cæcum du lapin (B).... 288
Figure 49. Comparaison de la structure de la communauté de bactérie en fonction des essais (A) et d’Archaea (B,
essais 1 et 2) dans le rumen de la vache et le cæcum du lapin par nMDS. ......................................................... 289
Figure 50. Comparaison de la structure des communautés de bactéries (A) et d’Archaea (C) entre le rumen et les
feces de la vache. Comparaison des profils CE-SSCP moyens du rumen et des feces (B). ................................ 294
Figure 51. Comparaison de la structure des communautés bactériennes entre les compartiments du rumen (A) et
entre les fractions (liquide, solide) au sein du sac ventral du rumen (B). Comparaison des profils CE-SSCP
moyens de la fraction solide et de la fraction liquide au sein du sac ventral du rumen (C). ............................... 296
Figure 52. Comparaison de la structure des communautés de bactéries (A) et d’Archaea (C) entre le cæcum, les
cæcotrophes et les crottes dures du lapin. Comparaison des profils CE-SSCP moyens du cæcum, des
cæcotrophes et des crottes dures (B). .................................................................................................................. 297
Figure 53. Comparaison de la richesse bactérienne (A), de la diversité de Simpson (B) et des densités de
bactéries, Firmicutes et Bacteroides Prevotella (C) entre la fraction liquide et solide du contenu ruminal du sac
ventral. ................................................................................................................................................................ 298
18
Figure 54. Effet de la perturbation induite par l’opération chirurgicale sur la structure de la communauté
bactérienne du cæcum du lapin (A). Comparaison des profils CE-SSCP moyens des communautés bactériennes
du cæcum avant et après la perturbation (B)....................................................................................................... 301
19
20
AGV ou VFA
Acide Gras Volatil
IBD
Inflammatory Bowel Disease
OTU
Operational Taxonomic Unit
ARN ou RNA
Acide RiboNucléique
ADN ou DNA
Acide DésoxyriboNucléique
MO
Matière Organique
MS
Matière sèche
C2
Acide acétique
C3
Acide propionique
C4
Acide butyrique
HGT
Hydrogénotrophie
DAPI
4',6' Di Amidino-2-Phényl Indole
SIP
Stable Isotope Probing
DGGE
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DGE
Denaturing Gel Electrophoresis
T-RFLP
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
SSCP
Single Strand Conformation Polymorphism
CE
Capillary Electrohoresis
ARISA
Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
mcr
Méthyle coenzyme-M réductase
SSH
Suppressive soustractive
FISH
Fluorescent In Situ Hybridization
PCR
Polymerase Chain Reaction
dNTP
2'-3'désoxynucléosides
ddNTP
2'-3'didésoxynucléosides
ATP
Adénosine TriPhosphate
PPi
PyroPhosphate
qPCR
Quantitative PCR
MGB
Minor groove binder
AFLP
Amplified Fragment-Length Polymorphism
TGGE
Temperature Gradient Gel Electrophoresis
ACP ou PCA
Analyse en Composante Principale
ANOSIM
Analysis Of SIMilarity
SIMPER
SIMilarity PERcentage procedure
MANOVA
Multivariate ANOVA
RDA
ReDundancy Analysis
21
22
23
24
Introduction générale
Le tractus digestif des animaux comporte des compartiments spécifiques appelés
fermenteurs digestifs qui contiennent des écosystèmes très complexes puisqu’ils abritent des
milliards de micro-organismes appartenant à des centaines d’espèces différentes. Chez les
mammifères herbivores, le microbiome est constitué de bactéries (1010-1012 cellules ml-1, 50%
de la biomasse, quelques centaines d’espèces), d’Archaea (107-109 cellules ml-1, souvent un
seul genre), de protozoaires (105-106 individus ml-1, 40 à 50% de la biomasse) et de
bactériophages (107-109 particules ml-1).
Les premiers travaux portant sur l’écologie microbienne du tube digestif ont été
réalisés au début du ΧΧème siècle par Metchnikoff mais ce n’est qu’à partir de 1950 que ces
écosystèmes ont commencé à être explorés d’abord par culture puis plus intensivement dès les
années 1980 par des méthodes moléculaires. La plupart des études ont été réalisées chez des
animaux présentant un intérêt économique (ruminants, porcs, poulets), un intérêt biomédical
(rongeurs) ou un intérêt écologique (termites). Chez les herbivores, ces micro-organismes ont
un rôle fondamental pour l’hôte qui les héberge car ils hydrolysent et fermentent les fibres
(cellulose, hémicellulose) qu’ils ingèrent mais qu’ils ne savent pas ou peu digérer par leurs
propres moyens. Cette activité microbienne produit des acides gras volatils (AGV) et de
l’ammoniac qui sont directement utilisables par l’hôte et qui permettent ainsi d’améliorer son
efficacité digestive. D’un point de vue plus général, les micro-organismes des fermenteurs
digestifs sont également indispensables pour le bon fonctionnement des méso-écosystèmes et
de l’écosystème planétaire car ils contribuent au transfert de l’énergie et du carbone entre le
règne animal et le règne végétal. En effet, ils permettent de rendre accessible aux
consommateurs primaires et en conséquence aux niveaux trophiques supérieurs une partie du
carbone et de l’énergie fixés dans les systèmes herbacés lors de la photosynthèse.
La caractérisation des communautés microbiennes et la compréhension du
fonctionnement des écosystèmes digestifs représentent un enjeu considérable d’un point de
vue cognitif mais aussi d’un point de vue finalisé (agronomique, médical et environnemental).
D’un point de vue agronomique, la perspective d’une maîtrise et d’une orientation du
microbiome vers une meilleure efficacité permettrait de mieux valoriser les ressources
alimentaires mondiales et assurerait une meilleure rentabilité économique des systèmes
d’élevage. Par ailleurs, l’Union Européenne affiche fortement sa volonté de réduire
l’utilisation d’antibiotiques en élevage. Une meilleure compréhension du fonctionnement des
écosystèmes digestifs chez les animaux de rente permettrait de proposer des stratégies
d’alimentation ou d’élevage limitant l’apparition des pathologies digestives. D’un point de
25
Introduction générale
vue médical, des études récentes ont mis en évidence le rôle des communautés microbiennes
des fermenteurs digestifs dans le développement de certaines maladies émergentes: obésité,
maladies inflammatoires du côlon (IBD avec notamment la maladie de Crohn), cancers
colorectaux etc. Une meilleure connaissance et un éventuel contrôle du microbiote pourrait
permettre de réduire la fréquence de ces maladies. D’un point de vue environnemental, les
fermentations digestives des animaux d’élevage engendrent une importante production de
méthane, puissant gaz à effet de serre. L’orientation métabolique du microbiote vers d’autres
voies d’hydrogénotrophie comme l’acétogenèse réductrice permettrait de diminuer ces
émissions de méthane. Tous ces questionnements sont porteurs d’enjeux sociétaux forts qui
fournissent autant de challenges pour les nutritionnistes et les écologues.
L’activité fermentaire (AGV, ammoniac) et les principaux paramètres du milieu (pH,
matière sèche etc.) des fermenteurs digestifs ont été bien décrits chez plusieurs espèces. En
revanche, les méthodes de culture microbienne ne donnent qu’une image très partielle de la
communauté microbienne qu’ils abritent et de son fonctionnement. Au contraire, les outils de
biologie moléculaire permettent une vision globale et rapide de ces microbiotes. Dans un
premier temps, il apparaît donc indispensable de caractériser le microbiote de ces écosystèmes
en termes de composition, de structure et de diversité, et de comprendre ses facteurs de
variabilité (entre espèces, entre individus, entre fermenteurs, dans le temps etc.). Dans un
second temps, il conviendra de définir des stratégies permettant de modifier et de contrôler le
fonctionnement de ces microbiotes.
Par conséquent, l’objectif de ce travail de thèse est de contribuer à une meilleure
connaissance de l’écologie des communautés procaryotiques des fermenteurs digestifs des
mammifères herbivores à l’aide des outils moléculaires. Nous nous sommes intéressés i) à
caractériser la variabilité taxonomique (entre espèces animales, entre individus), spatiale
(inter- et intra- fermenteurs digestifs) et temporelle des communautés procaryotiques, ii) à
établir le lien entre ces communautés et leur environnement et iii) à étudier les conséquences
d’une perturbation nutritionnelle sur ces écosystèmes. De plus, l’une des originalités de nos
travaux réside dans la comparaison des communautés procaryotiques dans deux modèles
animaux, la vache et le lapin, dont la physiologie digestive est très différente et représentative
des deux principales stratégies évolutives rencontrées chez les mammifères herbivores
actuels.
26
27
28
Etude bibliographique – Chapitre 1
Un fermenteur digestif se caractérise comme un organe du tube digestif dans lequel un
ensemble de processus mécaniques, chimiques et biologiques convertissent l’énergie contenue
dans les aliments en l'absence de dioxygène.
La particularité des fermenteurs digestifs en comparaison des autres organes digestifs
réside dans la densité et la diversité des micro-organismes présents. A titre d’exemple, les
bactéries du tube digestif de l’Homme sont dix fois plus nombreuses que les cellules
constituant le corps humain (Corthier et al., 2007). Chaque individu possédant un fermenteur
digestif est donc un individu dit « mosaïque » car, bien que constitué de soi, il est surtout
constitué de non soi.
Par définition, les herbivores, se nourrissent de matières végétales. La paroi des
matières végétales est principalement composée de cellulose et de lignine (Jarrige et al.,
1995b). La cellulose et la lignine assurent la structuration et la rigidité des végétaux. Or,
l’énergie d’origine carbonée contenue dans ces polymères végétaux est difficilement
accessible pour le niveau trophique supérieur, les consommateurs primaires. En effet, aucun
organisme eucaryote hétérotrophe1 ne possède l’équipement enzymatique permettant de
dégrader ces polymères. Seule l’action synergique d’un assemblage complexe de microorganismes permet de les dégrader (Pelmont, 1993). C’est donc pour permettre l’accès au
carbone stocké dans les systèmes herbacés que certains animaux ont développé des
fermenteurs digestifs. Leur importance est capitale car l’énergie emmagasinée lors de la
photosynthèse devient alors accessible et permet de boucler les réseaux trophiques et les flux
de carbone. Le fermenteur digestif est donc non seulement indispensable à l’hôte pour sa
digestion mais est aussi important à l’échelle des méso-écosystèmes et de l’écosystème
planétaire car il contribue aux transferts d’énergie et de carbone entre le règne animal et
végétal.
1
L’hétérotrophie est la nécessité pour un organisme vivant de se nourrir de constituants organiques préexistants,
d'origine animale ou végétale
29
Etude bibliographique – Chapitre 1
D’un point de vue évolutif, indirectement, les fermenteurs digestifs auraient également
contribué à la mise en place de la thermorégulation, à l’origine du succès évolutif des
homéothermes grâce à la chaleur constante issue des fermentations (Mackie, 2002).
Les fermenteurs digestifs sont des écosystèmes d’origine beaucoup plus récente que la
majorité des autres écosystèmes sur terre (Fenchel & Finlay, 1995; Thomasson & Voorhies,
1990). Les fermenteurs digestifs seraient apparus chez les premiers mammifères au milieu du
Paléocène par colonisation de micro-organismes opportunistes (Collinson & Hooker, 1991 ;
Farlow, 1987). Initialement, l’hôte et son microbiote étaient alors en compétition pour l’accès
à l’énergie et aux nutriments. La coévolution entre le génome de l’hôte et son microbiome2
ont permis le développement d’une relation compétitive mais à tendance coopérative que l’on
retrouve chez la plupart des mammifères herbivores actuels. Ce modèle davantage coopératif
s’illustre, par exemple, par la mise à disposition pour le microbiote du substrat cellulosique
non digérable par l’hôte. L’action du microbiote sur ce substrat aboutit entre autres à la
production d’AGV utilisés par l’hôte. Plus récemment, un mutualisme uniquement coopératif
est apparu avec l’émergence des ruminants sensu lacto qui possède un fermenteur préstomacal (Mackie, 2002). De ce fait, les fermenteurs situés en fin de tube digestif (cæcum
et/ou côlon) seraient apparus avant les fermenteurs pré-stomacaux (Hume & Warner, 1980;
Langer, 1991). L’essor évolutif d’une digestion microbienne a nécessité la mise en place
d’adaptations anatomiques et physiologiques chez l’hôte. En effet, la principale voie
métabolique des micro-organismes étant la fermentation, il a fallu mettre en place des
adaptations pour satisfaire leurs conditions écologiques. La fermentation est un processus qui
se réalise en l’absence de dioxygène mais qui est surtout relativement lente. De ce fait, les
mammifères herbivores ont allongé et élargie les organes de leur tube digestif en créant de
véritable « poches » qui permettent une stase alimentaire en ralentissant mécaniquement le
transit digestif (Mackie, 2002).
Le tractus gastro-intestinal des mammifères est structuré en une succession d’organes
dont l’épithélium est en contact avec le bol alimentaire : la bouche, l’œsophage, l’intestin
grêle (duodénum, jéjunum puis iléon), le cæcum, le côlon (proximal et distal), puis le rectum
abouchant à l’anus. A ces organes sont accolés quatre organes annexes : foie, vésicule biliaire,
pancréas et glandes salivaires. La structuration du tube digestif est similaire chez tous les
2
le microbiome désigne la somme des génomes des micro-organismes vivant dans le fermenteur digestif
30
Etude bibliographique – Chapitre 1
mammifères mais certains organes présentent des adaptations physiologiques et anatomiques
en fonction des contraintes du régime alimentaire.
Le tractus gastro-intestinal de la plupart des mammifères carnivores est relativement
court et simple (Tableau 1). L’estomac constitue généralement une dilatation unilatérale du
tractus digestif. Seuls les cétacés (Milinkovitch et al., 1993) et certaines chauves souris
présentent des exceptions avec un estomac compartimenté et volumineux. Le côlon n’est
généralement pas distinct de l’intestin grêle, et la valve de séparation est absente. Quand il est
distinct, le côlon est court, et inclus parfois un cæcum (certains rongeurs) et/ou de nombreux
haustra au niveau du côlon (Homme, singes, cochon).
31
Etude bibliographique – Chapitre 1
Tableau 1. Comparaison du tractus gastro-intestinal des mammifères.
Régime
alimentaire
Carnivore
Fermenteur
Souvent
absent
Estomac
Intestin
grêle
Simple
(sauf
Côlon-Cæcum
Schéma du tractus digestif
Court et peu
Court
cétacé)
développé (sauf
chien)
Taupe
Omnivore
Souvent
Simple
présent de
(sauf
Longueur
Longueur variable
type
certains
variable
mais souvent large
postérieur
rongeurs)
Ours noir
Chauve souris
Rat
Chien
Cochon
Cachalot
Homme
La taupe et la chauve souris d’après Stevens (1980), le chien et le rat d’après Stevens (1977), le cachalot, l’ours noir d’après Stevens et Hume (1995), le
cochon d’après Argenzio et Southworth (1974), l’homme d’après Wrong et al. (1981).
32
Etude bibliographique – Chapitre 1
Chez les herbivores, on distingue (Damuth, 1992) :
•
les herbivores se nourrissant exclusivement de fibres végétales : Lagomorpha
(lapin, lièvre, pika), Perissodactyla (chevaux, rhinocéros, tapires), Proboscidea
(éléphant), Sirenia (dugong, lamantin) et Hyracoidea (daman)
•
les herbivores se nourrissant de fibres et contenus végétaux : Artiodactyla
(cochon, hippopotame, camelidés, ruminants)
•
des animaux partiellement herbivores se nourrissant parfois de fibres et/ou de
contenus végétaux : Primates (lémurien, singes, homme, etc.), rongeurs (rat,
hamster, écureuil etc.), Edentata (fourmilier, tatou, paresseux), marsupiaux
(kangourou, opposssum, koala), certains carnivores (chien, ours, panda etc.).
Exception faite du Panda (Ailurinae) qui possède un tube digestif très simple mais
extrêmement long (Wei et al., 1999), les mammifères herbivores dégradent les matières
végétales dans des élargissements du tube digestif au niveau pré-stomacal, cæcal, ou colique.
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La caractéristique prédominante de la physiologie digestive des petits herbivores
(lagomorphe, daman, rongeurs herbivores, petits marsupiaux herbivores) est un large cæcum
qui sert de fermenteur digestif (Tableau 2). Le tractus gastro-intestinal présente un estomac
partiellement compartimenté chez certains rongeurs et chez les damans. Le daman possède en
plus des appendices au niveau du côlon qui servent de fermenteurs digestifs supplémentaires.
2
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Beaucoup de mammifères herbivores de grande taille possèdent un côlon élargit qui
sert de fermenteur digestif (Périssodactyle, éléphant, wombat, sirénien, orang-outang, gorille)
(Tableau 2). Le côlon mais aussi le cæcum de la plupart de ces espèces possèdent des haustra
sur toute leur longueur. Chez les Périssodactyles (équidés, rhinocéros) et les éléphants, les
haustra du côlon se sont accentués pour devenir de véritables compartiments, assurant une
meilleure efficacité en ralentissant le transit.
33
Etude bibliographique – Chapitre 1
Tableau 2. Comparaison du tractus gastro-intestinal des mammifères herbivores.
Type
Fermenteur
Type
Petite taille
postérieur,
très souvent
le cæcum
Grande
taille
+
fermenteur
postérieur
Estomac
Simple mais
souvent
compartimenté
Intestin
Côlon-
grêle
Cæcum
Taille
moyenne
Type
postérieur,
très souvent
Simple
Taille
moyenne
le côlon
Grande
Type
Large,
taille
antérieur,
compartimenté
+
l’estomac ou chez paresseux,
fermenteur
le pré-
lamas,
antérieur
estomac
ruminants
Schéma
Développé
surtout le
cæcum
Hamster
Lapin
Orang-outan
Cheval
Koala
Daman
Développé
surtout le
côlon
Eléphant
Dugong
Peu
Taille
développé
moyenne
sauf chez
lama.
Paresseux Kangourou
Colobe
Ruminant
Lama
Le hamster, l’orang outang, le cheval, le dugong, le lama d’après Stevens et Hume (1995), le lapin, le kangourou, la vache d’après Stevens (1977), le koala
d’après Harrop et Hume (1980), le daman d’après Clemens (1977), l’éléphant d’après Clemens et Maloiy (1982), le paresseux d’après Stevens (1980), le
colobe d’après Stevens (1983)
34
Etude bibliographique – Chapitre 1
4
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Les autres grands mammifères herbivores (artiodactyle, paresseux, marsupiaux
macropode, certains singes) comportent un estomac large, avec des haustra ou même
compartimenté en guise de fermenteur digestif (Tableau 2). Les Artiodactyles comprennent
les ruminants (bovin, ovin, caprin, girafe, antilope et cerf), les Tylopodes (chameaux,
dromadaire, lama, alpaga) et les suiformes (hippopotame, porcin, pécari, babirussa).
L’estomac des ruminants est le plus abouti et le plus efficace avec une division en 4
compartiments distincts qui agissent de façon complémentaire sur la dégradation du bol
alimentaire.
&
5
6
7
6
7
Comparer les fermenteurs digestifs des herbivores est une approche pertinente pour
mieux appréhender le fonctionnement des fermenteurs digestifs et leurs réponses aux facteurs
de variations. Aussi, nous avons choisi des modèles animaux qui possèdent des fermenteurs
digestifs anatomiquement et physiologiquement très différents et qui sont représentatifs des
principales stratégies évolutives rencontrées chez les mammifères herbivores actuels. Dans ce
travail de thèse nous avons donc étudié :
•
le modèle ruminant avec comme représentant spécifique la vache domestique (Bos
taurus). Son fermenteur est de grande taille, en position antérieure, avec une
complémentarité fonctionnelle de ces compartiments, et est basé sur le
mutualisme coopératif entre l’hôte et son microbiote;
•
le modèle lagomorphe avec comme représentant spécifique le lapin européen
(Oryctolagus cuniculus). Son fermenteur est de petite taille, en position
postérieure, avec de légères haustrations, et est basé sur le mutualisme compétitifcoopératif entre l’hôte et son microbiote.
&
.' %-
Le fermenteur digestif de la vache est le réticulo-rumen. Ce fermenteur se situe en
amont de l’estomac (abomasum). Entre le rumen et l’abomasum se trouve un autre
compartiment pré-stomacal : l’omasum (Comline et al., 1968).
35
Etude bibliographique – Chapitre 1
Le rumen pèse environ 100 kg chez la vache adulte (McDonald et al., 1981). Il se
subdivise en plusieurs poches : ventrale, dorsale, caudo-dorsale et caudo-ventrale (Figure 1A).
La muqueuse du rumen est plissée et couverte de papilles aplaties plus ou moins denses de 5
× 3 mm en moyenne (hauteur × largeur ; Figure 1B). La densité et la taille de ces papilles sont
liées à la stratification du digesta (Brownlee, 1956). Les papilles les plus hautes et les plus
nombreuses sont au contact de la phase liquide, c’est à dire au niveau des sacs ventral, caudodorsal et caudo-ventral. Au niveau du sac dorsal, les papilles sont peu nombreuses et petites.
Le réticulum (ou bonnet –filet en latin-) est un fermenteur de plus petite taille (Figure
1A). Il est accolé au rumen et son contenu est en communication permanente avec celui-ci.
D’un point de vue anatomique, son épithélium est garni d’arrêtes d’environ 0.2 × 5 mm
(épaisseur × hauteur) qui forment un motif hexagonal (nid d'abeille) de 2 à 5 cm de large
(Figure 1C).
Les papilles ruminales et les arrêtes du réticulum permettent d’augmenter la surface de
contact entre l’intérieur du rumen et les cellules de l’hôte. Cette augmentation de la surface et
donc de l’interface hôte/microbiote permet notamment d’absorber plus rapidement et donc
plus efficacement les produits issus des fermentations microbiennes.
36
Etude bibliographique – Chapitre 1
Figure 1. Anatomie générale du réticulo-rumen (A) et de l’épithélium ruminal (B) et réticulaire
(C).
2
"' , /' %. *+ /%. .+ "( /+1% "+- .'1
Le contenu du rumen n’est pas homogène mais stratifié en 3 couches appelées
« phases » : i) la phase liquide dans la partie ventrale qui contient les fines particules
alimentaires et le jus ruminal, ii) la phase solide dans la partie intermédiaire essentiellement
composée de grosses particules et de gaz iii) et la phase gazeuse dans la partie dorsale du
rumen (Welch, 1982). A l’inverse, le contenu du réticulum n’est pas stratifié et présente une
seule phase liquide composée de fines particules et de jus.
4
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"+- .' %.
Une fois avalé, le bol alimentaire se dépose au niveau du réticulum. Les contractions
du réticulum et du rumen poussent et mélangent le bol alimentaire dans la phase solide du
contenu ruminal. La fermentation microbienne dégrade les particules alimentaires en libérant
du gaz. Une partie de ces gaz est emprisonnée dans la phase solide, ce qui lui permet de
« flotter » à la surface de la phase liquide. Une fois le substrat fermentescible du bol
alimentaire épuisé, les diminutions de production de gaz et la diminution de la taille des
particules entrainent une perte de flottabilité du bol alimentaire qui se dépose alors dans la
phase liquide du rumen (Beaumont & Deswysen, 1991). Les contractions ruminales poussent
cette phase liquide vers le réticulum. Dans le réticulum, les grosses particules restant du bol
37
Etude bibliographique – Chapitre 1
alimentaire sont régurgitées dans la bouche pour être ruminées (mastication et ajout de salive)
puis ré-avalées en suivant le cycle expliqué ci-dessus. Les petites particules sont acheminées
dans le dans l’omasum (Clauss & Lechner-Doll, 2001). La partie liquide (eau, salive) est soit
absorbée par l’épithélium du réticulum soit acheminée vers l’omasum avec les fines
particules. La partie dorsale du rumen est remplis de gaz essentiellement libérés par l’activité
microbienne. Ces gaz sont régulièrement éructés par la bouche.
8
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L’omasum permet le recyclage de l'eau et de certains minéraux (surtout le sodium et le
phosphore) qui sont absorbés dans le sang et retournent dans le rumen via la salive. En dépit
de sa petite dimension, l’omasum a une grande capacité d'absorption. Cependant, l’omasum
ne serait pas un organe essentiel puisqu’il est absent chez les Tylopodes (ruminant sensu lato :
chameaux, lamas, alpagas etc.).
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L’abomasum des ruminants correspond au vrai estomac des espèces monogastriques et
présente peu de différences avec celui de ces dernières : sécrétion de mucus, d’acide
chlorhydrique et d’enzymes digestives respectivement par les gastrocytes, les cellules
pariétales et les cellules principales. Cependant, l’épithélium stomacal des ruminants sécrète
une enzyme essentielle au mode de digestion des ruminants : le lysozyme gastrique. La
fonction initiale du lysozyme chez les mammifères était de protéger le tube digestif contre
l’attaque des bactéries pathogènes allochtones en les lysant (Irwin & Wilson, 1990). Chez les
ruminants, le lysozyme a évolué pour fonctionner dans le contenu stomacal : activation à un
pH acide et résistance à la pepsine (Dobson et al., 1984; Stewart et al., 1987). De ce fait, et
contrairement à tous les autres mammifères (sauf les singes Colobinae), cette adaptation a
permis aux ruminants d’utiliser les nutriments et l’énergie contenus dans les microorganismes en plus de ceux issus de l’activité en amont de ces mêmes micro-organismes
(Dobson et al., 1984 ; Jolles et al., 1989).
&
;
Le cæcum et le côlon de la vache jouent un rôle secondaire dans la dégradation des
polymères végétaux par rapport aux pré-estomacs qui assurent 80 à 90% de la capacité de
fermentation du tube digestif (Hungate, 1966).
38
Etude bibliographique – Chapitre 1
;
Le cæcum est le fermenteur digestif principal du lapin. Du fait de sa position distale, le
bol alimentaire entre dans le cæcum partiellement dégradé (Tableau 3).
Tableau 3. La dégradation des nutriments dans le tractus gastro-intestinal du lapin
bouche
estomac
intestin
cæcum
Dégradation des protéines
-
+++
++
+
Dégradation des lipides
+
++
+++
+
-
+++
+
-
-
+++
Dégradation des glucides non +
fibreux
Dégradation des fibres végétales -
Abbréviations : -, pas dégradé ; +, peu dégradé ; ++, en partie dégradé ; +++, majoritairement dégradé.
L’aliment entre dans la bouche où il est mastiqué (jusqu'à 120 mouvements de
mâchoire par minute) pour réduire la taille des particules alimentaires. Une lipase linguale
(Denigris et al., 1988) et une enzyme amylolytique (Blas et al., 1988) commencent la
dégradation du bol alimentaire. Le bol alimentaire transite alors dans l'estomac où il y subit
des transformations chimiques et un brassage important durant 1,7 et 4 heures (Gidenne,
1987). L’estomac assure :
•
la dénaturation et la lyse des protéines en peptides par l’action conjuguée de la
pepsine et d’acidité. L’acidité de l’estomac du lapin est très forte
comparativement aux autres mammifères: pH=1,5 à 2,6 (Marounek et al., 1995;
Penney R.L., 1986) ;
•
la lyse des acides gras à chaînes courtes ou moyennes par la lipase gastrique. La
sécrétion de la lipase gastrique chez le lapin est
proportionnellement plus
importante que celle de la majorité des autres mammifères (Denigris et al., 1988;
Moreau et al., 1988) ;
•
l’utilisation de la vitamine B12 grâce à la sécrétion d’une glycoprotéine : facteur
intrinsèque3 (Serfilippi & Donaldson, 1986)
•
la lyse des micro-organismes allochtones grâce aux sécrétions acides (Martinsen
et al., 2005).
3
Le facteur intrinsèque est une glycoprotéine qui, en association avec la vitamine B12 elle-même, permet la
maturation des érythrocytes en hématies
39
Etude bibliographique – Chapitre 1
Le bol alimentaire transite de l’estomac vers l’intestin grêle. L’intestin grêle mesure
environ 3 mètres de long. Le temps de transit du bol alimentaire dans l’intestin est estimé à 1
heure 30 (Vernay & Raynaud, 1975). La protéolyse amorcée dans l'estomac se poursuit sous
l’action des protéases pancréatiques (trypsine, chymotrypsine et élastase pancréatique) et des
peptidases. La lyse des lipides alimentaires se poursuit grâce à diverses enzymes
pancréatiques :
•
la lipase et la colipase pancréatique responsables de l'hydrolyse des triglycérides
•
la phospholipase A2 et la cholestérol-estérase à l'origine de l'hydrolyse des autres
composés lipidiques (phospholipide, cholestérol, ester de cholestérol etc.).
Les glucides non fibreux sont lysés notamment grâce à l'amylase pancréatique
(Corring & Rérat, 1983).
;
Le bol alimentaire transite de l'intestin grêle vers la base du cæcum par le sacculus
rotondus. Le cæcum représente un compartiment en dérivation sur l'axe intestin grêle-côlon
(Snipes, 1978). Il pèse 150 g et représente 49% du volume total du tube digestif (Portsmouth,
1977). Il est en forme de spirale comprenant 22 à 25 spires (Figure 2). A son extrémité se
trouve l'appendice cæcal ou vermiforme de diamètre nettement plus faible (1cm contre 45cm), et constitué de tissu lymphoïde. Près de l'abouchement de l'intestin grêle se trouve le
départ du côlon, au niveau de l'ampulla coli.
40
Etude bibliographique – Chapitre 1
;
Figure 2. Morphologie du cæcum du lapin.
D’après Barone et al. (1973)
La muqueuse cæcale ne forme pas de villosités, à l’opposé du fermenteur digestif des
ruminants, mais présente des cryptes. La surface luminale est composée d'un épithélium
prismatique simple, présentant une bordure de microvillosités bien développée et tapissée d'un
glycocalyx. Des cellules à mucus sont présentes en faible quantité et des lymphocytes et
leucocytes ont également été identifiés. L'épithélium des cryptes comprend des cellules
indifférenciées, des cellules à mucus, des cellules épithéliales immatures et des cellules
endocrines. Des lymphocytes sont présents dans la lamina propria (Ross et al., 1989).
Le côlon, qui fait suite au cæcum, mesure environ 115-135 cm de long. Il est subdivisé
en 2 parties : le côlon proximal et le côlon distal, séparés par le fusus coli (Figure 3).
41
Etude bibliographique – Chapitre 1
2= 9'"
<
5
<
= 9'"
Figure 3. Représentation schématique du côlon du lapin
A = ampoule cæcale, C = cæcum; D'après Snipes et al. (1982)
Le côlon proximal est lui-même subdivisé en 2 segments. Le premier segment
comporte des haustra sur tout son contour dont le rôle est d’aider à la séparation des phases
solide et liquide lors de la production des crottes. Le deuxième segment présente des haustra
plus accentués mais sur une seule rangée. Le fusus coli, long de 3 à 4 cm, possède une paroi
très épaisse, densément nervée, lui permettant de jouer une activité de presse (pacemaker) et
en évacuant l’eau de mouler les crottes dures. Le côlon distal possède une paroi fine et lisse se
déformant au passage des crottes et cæcotrophes. Le côlon abouche ensuite sur le rectum, puis
sur l’anus. La muqueuse colique contient de nombreuses cellules à mucus qui lubrifient et
facilitent le passage des crottes dures (Snipes et al., 1982).
;
Le lapin produit deux types d'excréments (Tableau 4):
•
les crottes dures qui sont éliminées dans le milieu environnant. Ces crottes dures
sont assimilables aux excréments des autres animaux ;
•
les cæcotrophes qui sont ingérés par l’animal puis stockés dans l’estomac
(Gidenne & Poncet, 1985). L’ingestion des cæcotrophes permet au lapin d’utiliser
l’énergie et les nutriments contenus dans les organismes microbiens, en plus de
ceux produits par leur activité dans le cæcum. Ces micro-organismes sont alors
majoritairement lysés dans l’estomac et absorbés dans l’intestin grêle. Cependant,
42
Etude bibliographique – Chapitre 1
la majorité de l’énergie et des nutriments contenus dans les microorganismes
microbiens sont perdus par l’excrétion des crottes dures.
La production de cæcotrophes et de crottes dures présente un rythme circadien régulé
par la photopériode (Carabaño & Merino, 1996; Jilge, 1982) mais qui peut être affecté par le
stade physiologique des animaux (Bellier et al., 1995; Lorente et al., 1988) ou la restriction
alimentaire (Fioramonti & Ruckebusch, 1976).La cæcotrophie est généralement une activité
diurne (de 9 h à 17 h) tandis que l’ingestion et la production de crottes est davantage une
activité nocturne (4 h à 7 h et 15 h à 24 h ; Bellier & Gidenne, 1996; Lebas & Laplace, 1974).
La production des crottes dures résulte d’une séparation mécanique des différents
composants du bol alimentaire au sein du côlon proximal (Björnhag, 1972; Pickard &
Stevens, 1972). Durant l’excrétion de crottes dures, les substances solubles dans l’eau et les
fines particules (<0.3 mm de diamètre) sont rapportées dans le cæcum par les mouvements
péristaltiques du cæcum provoquant un flux inverse (rétrogradé). Les grosses particules (>0.3
mm) passent dans la partie distale du côlon. En revanche, lors de la production de
cæcotrophes, les mouvements péristaltiques de la base du cæcum et surtout du côlon proximal
diminuent (Ruckebusch & Hörnicke, 1977). Cette activité motrice serait régulée par les
prostaglandines (Pairet et al., 1986).
;
La composition des cæcotrophes et des crottes dures est différente (Tableau 4). Les
cæcotrophes sont riches en protéines, vitamines et minéraux, tandis que les crottes dures sont
majoritairement constituées de fibres. Les cæcotrophes constituent 9 à 15% de l’ingéré
journalier dont 15-20% des apports azotés journaliers (Belenguer et al., 2005; Garcia et al.,
1995). Ces protéines, d’origine microbienne, sont riches en acides aminés essentiels : lysine,
thréonine et méthionine (Ferrando et al., 1972). Les cæcotrophes sont également riches en
vitamine K et B (Garcia et al., 1995; Spreadbury, 1978).
43
Etude bibliographique – Chapitre 1
Tableau 4. Comparaison de la composition des crottes dures et des cæcotrophes du lapin
Crottes dures
Cæcotrophes
Eau (%)
43-48
61-71
Protéines brutes (% MS)
11-15
26-32
2.7
2.2
Cellulose brute (% MS)
29-30
17-18
Minéraux (% MS)
5-14
8-15
Lipide (% MS)
D’après Carabaño et al., 1988, Fekete & Bokori, 1985, Fraga et al., 1991, Proto, 1965
D’un point de vue morphologique, les crottes dures ressemblent à des agrégats de
taille moyenne (8 à 12 mm), bruns, durs et secs. Les cæcotrophes se présentent toujours sous
forme de grappe composée d’agrégats de petite taille (5 mm), foncés, mous et entourés de
mucus.
44
Etude bibliographique – Chapitre 1
Tableau 5. Physiologie comparative de la vache et du lapin
Vache
Lapin
Références
CUDa4 de la cellulose brute
35-45%
16-18%
(Hintz, 1969)
Poids
100 kg
0.15kg
(McDonald et al.,
1981; Portsmouth,
1977)
Temps
de
rétention
des
28-38h
particules
Grosses : 7-16
(Gidenne, 1992;
Fines : 16-42h
Hartnell & Scatter,
1979 )
Utilisation
produite
de
par
l’énergie
les
oui
oui
oui
partielle
coopératif
compétitif-coopératif
micro-
organismes
Utilisation
de
l’énergie
contenue dans les microorganismes
Mutualisme
(Mackie, 2002)
Le rumen de la vache et le cæcum du lapin possèdent une fonctionnalité commune : la
dégradation des fibres végétales. Le cæcum du lapin assure essentiellement cette fonction
tandis que le rumen de la vache permet aussi la dégradation des composés glucidiques non
fibreux, des lipides et des protéines. Les positions respectives de ces fermenteurs au sein du
tube digestif expliquent ces différences fonctionnelles. En effet, situé juste après l’œsophage,
le rumen reçoit des aliments presque bruts et donc de composition très complexe. En
revanche, situé après l’intestin grêle, le cæcum reçoit les nutriments restants qui n’ont pas été
digérés dans l’estomac et l’intestin grêle et qui sont essentiellement des fibres végétales.
L’intrant qui arrive dans le fermenteur cæcal est donc assez homogène et régulier tandis que
celui du rumen subit les variations dues à la composition de la ration (matières premières), et
comportement alimentaire (ingestion, rumination, abreuvement).
Le fermenteur digestif de la vache est deux fois plus efficace que celui du lapin pour la
digestion des fibres pour 3 raisons principales (Hintz, 1969; Slade & Hintz, 1969):
4
CUDa : coefficient d’utilisation digestive apparent (net)
45
Etude bibliographique – Chapitre 1
•
les conditions écologiques du rumen sont plus favorables pour le microbiote que
celles du cæcum. En effet, le rumen est environ 650 fois plus volumineux que le
cæcum (Tableau 5). De ce fait, le transit des polymères végétaux est ralentit et le
temps de rétention des particules fibreuses est plus long (Pickard & Stevens,
1972). Or, les fermentations microbiennes (principales réactions dans les
fermenteurs digestifs) sont des processus lents. Un temps de contact élevé entre
les particules et les micro-organismes augmente leur pouvoir de dégradation.
•
la rumination permet un broyage mécanique des grosses particules et « fissure »
les fibres végétales rendant ainsi plus accessible au microbiote le contenu végétal.
L’utilisation de l’énergie et des nutriments contenus dans les micro-organismes est
totale chez le ruminant alors qu’elle n’est que partielle chez le lapin (Tableau 5). En effet,
chez la vache les micro-organismes transitent dans l’estomac et sont lysés efficacement sous
l’action du lysozyme stomacale (Jolles et al., 1989). Chez le lapin, seuls les micro-organismes
présents dans les cæcotrophes lors de leurs émissions ponctuelles sont utilisés comme source
de nutriment et d’énergie.
En résumé, au cours de l’évolution, les mammifères herbivores ont développé au
sein de leur tube digestif des élargissements favorisant les fermentations, appelés
fermenteurs digestifs. Ces fermenteurs accueillent un microbiote symbiotique qui leur
permet d’utiliser l’énergie contenue dans les fibres végétales. Chez les mammifères
herbivores actuels, on rencontre trois types de fermenteurs représentant trois stratégies
évolutives : les fermenteurs cæcaux (animaux de petite taille), les fermenteurs coliques
(animaux de gande taille) et les fermenteurs stomacaux (animaux de grande taille). Afin
de mieux caractériser les écosystèmes présents dans ces fermenteurs, nous avons utilisé
au cours de notre travail deux modèles animaux : le lapin, modèle des fermenteurs
cæcaux et la vache, modèle des fermenteurs stomacaux. Ces deux types de fermenteurs
présentent des différences importantes en terme de volume, compartimentation, type de
mutualisme hôte/microbiote et composition des intrants.
46
Etude bibliographique – Chapitre 2
> >
>
Parmi la diversité du monde animal, bien peu d’écosystèmes digestifs ont été explorés.
De ce fait, les connaissances actuelles proviennent uniquement de quelques animaux qui
présentent un intérêt économique (ruminant, porc, volaille), expérimental (rat, souris) ou
environnemental (termite). L’écosystème digestif de l’homme a aussi été très étudié pour des
raisons cognitives et médicales (maladie de Crohn, Seksik et al., 2003 ; obésité, Raoult,
2008).
Les micro-organismes qui peuplent les fermenteurs digestifs appartiennent aux trois
domaines du vivant : Bacteria (procaryote), Archaea (procaryote) et Eucarya (Tableau 6 ;
Figure 4). Les virus, non considérés comme être vivant mais comme entité biologique, sont
également présents.
Tableau 6. Groupes microbiens présents dans les fermenteurs digestifs des mammifères
Procaryote
Eucaryote
Vache
Lapin
Cheval
Porc
Homme
Chien
Bactérie
+
+
+
+
+
+
Archaea
+
+
+
+
+
+
Protozoaire
+
+
+
-
-
-
Champignon
+
-
+
-
-
-
-/+
+
-
-
-
-
+
?
+
?
+
?
Levure
Entité
biologique
Virus
D’après Fonty et Chaucheyras-Durand (2008c). Abbréviations : +, présent ; - , absent ; ?, pas encore
étudié
47
Etude bibliographique – Chapitre 2
Myoviridae
Siphoviridae
Saccharomycetes
Saccharomyces sp.
Virus
26-40 types
morphologiques
Eurotiomycètes
(moissisure)
Penicillium sp.
Aspergillus sp.
Autres ?
Chytridiomycetes
(champignon anaérobie)
Caecomyces sp.
Neocallimastix sp.
Pyromyces sp.
Orpinomyces sp.
Anaeromyces sp.
Podoviridae
Mycota
Metamonada (flagellé)
Methanobacteriales
Eucarya
Methanobrevibacter
Methanobacterium
Methanomicrobiales
Protozoa
Archaea
Chilomastix
Monocercomonoides
Pentatrichomonas
Tetratrichomonas
Ciliophora
Methanomicrobium
Entodiniomorphe
Methanosarcinales
Entodinium
Diplodinium
Eudiplodinium
Diploplastron
Polyplastron
Epidinium
Ophryoscolex
Methanosarcina
Bacteria
VadinBE9 7
Eodinium
Eremoplastron
Ostracodinium
Metadinium
Enoploplastron
Elytroplastron
Epiplastron
Holotriche
Isotricha
Dasytricha
Buetschlia
Charonina
Verrucomicrobi
Fusobacteria
Firmicute
Acetomaculum ruminis
Anaerovibrio lipolytica
Bacillus subtilis
Eubacterium cellulosolvens
E. pyruvovorans
E. rectale
E. ruminantium
E. siraeum
E. uniforme
Clostridium aerotolerans
C. aldrichii
C. aminophilum
C. celerecrescens
C. cellulobioparum
C. cellulosi
C. chartatabidum
C. clostridiiforme
C. longisporum
C. polysaccharolyticum
C. proteoclasticum
C. thermocellum
C. viride
C. xylanolyticum
Butyrivibrio crossotus
B. fibrisolvens
Pseudobutyrivibrio ruminis
P. xylanivorans
Lachnobacterium bovis
Selenomonas ruminantium
Syntrophococcus
Lactobacillus ruminis
L. vitulinus
Mycoplasma bovis
M. mycoides
Oscillospira guillermondii
Mitsuokella jalalundinii
M. multiacida
Quinella ovalis
Ruminococcusalbus
R. bromii
R. flavefaciens
R. gnavus
R. productus
R. schinkii
Schwartzia succinivorans
Megasphaera elsdenii
Streptococcusbovis
S. gallolyticus
Succinoclasticum ruminis
Termitobacteraceticus
Veillonela dispar
Bacteroidetes
Actinobacteria
Proteobacteria
Bacteroides distasonis
B. fragilis
B. vulgatus
Chlorobium vibrioforme
Cytophaga hutchinsonii
Prevotellabuccalis
P. corporis
P. denticola
P. ruminicola
P. bryantii
P. brevis
P. albensis
Fibrobacter succinogenes
Atopobium parvulus
Cellulomonas flavigena
Denitrobacterumdetoxificans
Slackia heliotrinreducens
Frankia sp.
Prauserella rugosa
Actinomycesbovis
Bifidobacteriumboum
B. lactis
B. merycicum
B. pseudolongum
B. ruminantium
B. thermophilum
Ruminobacteramylophilus TreponemaBryantii
.T. saccharophilum
Cowdria ruminantium
Escherichia coli
Actinobacillus succinogenes
Succinivibriodestrinosolvens
Rhodospilliumrubrum
Myxococcusxanthus
Succinimonasamylolytica
Oxalabacterformigenes
Synergistesjonesii
Wolinella succinogenes
Figure 4.Taxons microbiens mis en évidence dans les fermenteurs digestifs
48
Spirochaetes
Etude bibliographique – Chapitre 2
Toutefois, la présence de ces principaux groupes biologiques semble varier en fonction
des espèces animales qui les abritent (Tableau 6). Les bactéries, les Archaea et les eucaryotes
ont été détectés chez toutes les espèces de mammifères herbivores étudiés (Fonty &
Chaucheyras-Durand, 2008c) : ruminant, lapin, cheval etc. En revanche, aucune espèce
n’appartenant au domaine eucaryote n’a été mise en évidence dans les fermentateurs digestifs
des mammifères carnivores et de certains omnivores tel l’Homme, le porc, ou le chien (Fonty
& Chaucheyras-Durand, 2008c). Des virus ont été détectés à la fois dans les fermenteurs de
certains herbivores (vache ; Klieve & Swain, 1993 ; cheval, Cann et al., 2005), et de certains
omnivores (Homme, Zhang et al., 2006). Toutefois, les entités biologiques de type viral ou
autre ont été rarement recherchées.
En ce qui concerne nos deux modèles : le rumen de la vache contient 1010 à 1011
bacteries, 107 à 109 Archaea, 108 à 109 protozoaires (ciliés et flagellés), 103-105 zoospores de
champignon et 109 à 1010 particules virales par millilitre (Klieve & Swain, 1993; Mackie et
al., 1997) ; le cæcum du lapin contient 109 à 1010 bacteries par gramme (Gouet & Fonty,
1979; Padilha et al., 1995), des Archaea (Bennegadi et al., 2003), des protozoaires (cilié et
flagellé ; Lelkes & Chang, 1987) mais ne semble pas contenir de champignons (Bennegadi et
al., 2003). A notre connaissance aucune étude ne s’est attachée à mettre en évidence la
présence de virus dans le cæcum du lapin. Des travaux complémentaires seraient nécessaires
chez le lapin pour quantifier les communautés d’Archaea et de protozoaires et confirmer
l’absence de champignons.
La communauté bactérienne des fermenteurs digestifs se distingue des autres
écosystèmes microbiens par :
•
une proportion importante de bactéries par rapport aux autres domaines du
vivant (Archaea, eucaryote) ;
•
des espèces appartenant à très peu de divisions taxonomiques;
•
une forte diversité spécifique et intra-spécifique.
49
Etude bibliographique – Chapitre 2
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La communauté bactérienne des fermenteurs digestifs est largement majoritaire par
rapport aux Archaea et aux eucaryotes. La densité de la communauté bactérienne est estimée
à 1010-1011 cellules par gramme, dans le rumen de la vache (Habel, 1975; Hungate, 1966), le
côlon du porc (Butine & Leedle, 1989), le côlon humain (Cummings et al., 1990) et le cæcum
du lapin (Bonnafous & Raynaud, 1970; Forsythe & Parker, 1985a; Gouet & Fonty, 1979;
Penney R.L., 1986). Toutefois, les densités bactériennes varient en fonction des individus au
sein d’une même espèce hôte mais aussi en fonction de la technique d’estimation utilisée.
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Figure 5. Arbre phylogénétique des divisions bactériennes présentes dans le côlon humain au
sein de toutes les divisions bactériennes existantes.
D’après Backhed et al. (2005). Les divisions majoritaires, rares et absentes sont respectivement en
rouge, vert et noir.
50
Etude bibliographique – Chapitre 2
La classification actuelle décompose le domaine des bactéries en un premier rang
taxonomique appelé division. A l’heure actuelle, 55 divisions bactériennes ont été reconnues.
Dans les fermenteurs digestifs, seules 3 divisions sont présentes : les Firmicutes, les
Bacteroidetes (ou CFB5) et les Proteobacteria (Figure 5). Cette diversité bactérienne est la
plus faible de tous les écosystèmes microbiens étudiés. A titre de comparaison, les
communautés bactériennes des sols contiennent régulièrement plus de 20 divisions (Dunbar et
al., 2002). Cette faible diversité traduit probablement les fortes contraintes écologiques (pH,
potentiel redox, anaérobiose) et la spécialisation fonctionnelle des écosystèmes digestifs.
Les Firmicutes sont toujours majoritaires et représentent entre la moitié et les deux
tiers des espèces bactériennes présentes dans les écosystèmes digestifs. Elles sont
généralement accompagnées d’environ un tiers de Bacteroidetes. Les Proteobacteria sont
également communes mais elles ne sont jamais dominantes chez les individus sains (Seksik et
al., 2003). Dans le rumen de la vache, on observe 49% (phase liquide) à 69% (phase solide)
de Firmicutes, 39% (phase liquide) à 29% (phase solide) de Bacteroidetes (Tajima et al.,
1999) alors que chez le lapin les Firmicutes représentent 93% du microbiote et les
Bacteroidetes en représentent 4% (Monteils et al., 2008).
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Différentes méthodes ont été utilisées pour déterminer le nombre d’espèces
bactériennes présentes dans les fermenteurs digestifs : microscope, estimation à partir de
séquençage aléatoire de banque de clone ou plus récemment détermination par un
pyroséquençage exhaustif. Bien que la quantité estimée varie en fonction de la méthode
utilisée, tous les travaux convergent vers un nombre de 300 à 1000 espèces bactériennes en
fonction des espèces animales et même des individus au sein de la même espèce. Les récents
travaux utilisant la technologie du pyroséquençage indiquent 274 espèces bactériennes dans la
bouse des ruminants (Dowd et al., 2008), entre 609 et 5600 OTUs (97% de similarité) chez
l’Homme (Andersson et al., 2008; Dethlefsen et al., 2008), environ 5000 OTUs (97% de
similarité) chez le macaque (McKenna et al., 2008).
La quasi-totalité des bactéries des fermenteurs digestifs provient des 8 genres
suivants : Bacteroides (division : Bacteroidetes), Clostridium (division : Firmicutes),
Fusobacterium (division : Fusobacteria), Eubacterium (division : Firmicutes), Ruminococcus
(division : Firmicutes), Peptococcus (division : Firmicutes), Peptostreptococcus (division :
5
pour Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides
51
Etude bibliographique – Chapitre 2
Firmicutes), et Bifidobacterium (division : Actinobacteria) (Figure 5 ; Figure 6). D’autres
genres comme Escherichia (division : Proteobacteria) et Lactobacillus (division : Firmicutes)
sont présents mais dans une moindre mesure.
Figure 6. Les principaux genres bactériens des fermenteurs digestifs: Bacteroides sp. (A),
Clostridium sp. (B), Fusobacterium sp. (C), Eubacterium sp. (D), Ruminococcus sp. (E),
Peptostreptococcus sp. (F) et Bifidobacterium sp. (G).
A l’échelle spécifique et intra-spécifique, la communauté bactérienne des fermenteurs
digestifs est extrêmement diversifiée. Les approches culturales ont mis en évidence une
grande variabilité phénotypique des isolats au sein d’une même espèce bactérienne (Piknova
et al., 2004). Ces bactéries sont souvent endémiques6 aux fermenteurs digestifs suggérant une
forte coévolution microbiote-hôte (Hedlund & Staley, 2002).
Les Archaea possèdent des métabolismes très variés et se retrouvent dans de
nombreux écosystèmes (Delong & Pace, 2001). Cependant, celles présentes dans les
fermenteurs digestifs sont strictement anaérobies et toutes méthanogènes (Jones et al., 1987).
Historiquement, les Archaea ont été très peu étudiées dans les fermenteurs digestifs en
raison de leur forte exigence quant à l’anaérobiose, rendant leur culture difficile. Récemment,
le développement des outils moléculaires associé à l’intérêt accru pour les organismes
responsables de la méthanogènese chez les animaux d’élevage ont permis la réalisation de
nombreuses études sur ces micro-organismes. La méthanogènese est la principale activité
métabolique des Archaea des fermenteurs digestifs. Cette réaction utilise le dihydrogène
produit par l’hydrolyse et la fermentation de la matière organique pour réduire le dioxyde de
carbone en méthane (4H2 + CO2 => CH4 + H2O ; Demeyer & Fievez, 2000). Certaines
6
la présence naturelle d'un groupe biologique exclusivement dans une zone géographiquement délimitée.
52
Etude bibliographique – Chapitre 2
espèces d’Archaea utilisent également le dihydrogène pour réduire le formate dans les
systèmes
digestifs
(Methanobrevibacter
ruminatium,
Methanobacterium
formicum,
Methanomicrobium mobile ; Rea et al., 2007). La réduction de l’acide acétique, du méthanol
et les méthylamines n’ont pas, à l’heure actuelle, été mise en évidence dans le rumen
(Yanagita et al., 2000).
Les Archaea représentent une faible proportion des micro-organismes présents dans
les fermenteurs digestifs. L’ARN ssu7 des Archaea ne représente que 0.3 à 3.3% de l’ARN
ssu total dans les fermenteurs digestifs (Lin et al., 1997; Sharp et al., 1998; Ziemer et al.,
2000). La communauté d’Archaea semble être, en proportion, deux fois plus importante dans
le cæcum du lapin (3.4% de l’ARN ssu total ; Bennegadi et al., 2003) que dans le rumen de la
vache (1.5% de l’ARN ssu total ; Sharp et al., 1998).
Dans les fermenteurs digestifs des mammifères, la communauté des Archaea est très
peu diverse (Figure 7). Le genre qui prédomine est Methanobrevibacter (ordre :
Methanobacteriales)
parfois
associé
avec
quelques
Methanomicrobium
(ordre :
Methanomicrobiales), Methanobacterium (ordre : Methanobacteriales) et Methanosarcina
(ordre : Methanosarcinales ; Garcia et al., 2000; Jarvis et al., 2000; Wright et al., 2008). Par
exemple, un inventaire récent démontre que dans le rumen du mouton seulement 14 OTUs
(97% similarité) sont présents (Wright et al., 2008). 95,2% et 39.4% des clones appartiennent
respectivement au genre Methanobrevibacter et à l’espèce Methanobrevibacter gottschalkii.
Le méthane issu de l’activité des Archaea est un puissant gaz à effet de serre (Moss et
al., 2000; Moss, 1993), ce qui rend la connaissance des Archaea et de leur fonctionnement
important dans le contexte de réchauffement climatique actuel. En plus de cet intérêt
environemental global, le méthane émis par les fermenteurs digestifs représente également
une perte de 6 à 8% de l’énergie et du carbone ingérés par l’animal et présente donc un enjeu
économique pour l’agriculture (Boadi et al., 2004; Johnson & Johnson, 1995). Cependant,
l’élimination du dihydrogène inhérent à la réaction de méthanogenèse est indispensable à un
fonctionnement optimal des fermenteurs digestifs. En effet, l’élimination du dihydrogène
permet, en diminuant le potentiel réducteur de l’écosystème, de rendre possible et de favoriser
thermodynamiquement les hydrolyses et les fermentations de la matière organique (Lange et
al., 2004). Une des perspectives pour la réduction des émissions de méthane serait de
favoriser la consommation du dihydrogène par des espèces bactériennes hydrogénotrophes
par la voie de l’acétogenèse réductrice (Ruminococcus hydrogenotrophicus, Clostridium spp.,
7
16S et 18S
53
Etude bibliographique – Chapitre 2
Streptococcus spp. ; Joblin, 1999). De récents travaux ont aussi démontré que certaines
espèces d’Archaea pourraient être impliquées dans des événements pathologiques
(Cavicchioli et al., 2003; Eckburg et al., 2003; Vianna et al., 2006).
Figure 7. Les Archaea présentes dans les fermenteurs digestifs au sein de l’arbre phylogénétique
des Archaea.
En rouge encadré, les ordres d’Archaea méthanogènes présents dans les fermenteurs digestifs.
54
Etude bibliographique – Chapitre 2
Du fait de leurs grandes tailles (20 à 100 fois plus grands que les bactéries ; Jouany,
1994) et de leurs identifications faciles au microscope, les eucaryotes colonisant les
fermenteurs digestifs ont été très étudiés, et plus particulièrement chez les ruminants. La
communauté eucaryote a été évaluée de 105 à 106 cellules par millilitre dans le contenu
ruminal (McAllister & Cheng, 1996). Chez le lapin, les eucaryotes représentent 7% de l’ARN
ssu total du microbiote cæcal (Bennegadi et al., 2003).
Deux règnes d’organisme du domaine des eucaryotes vivent dans les fermenteurs
digestifs (Figure 4):
• les protozoaires : organismes unicellulaires eucaryotes ;
• les champignons : organismes pluricellulaires eucaryotes (sauf la levure qui est
unicellulaire).
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Les protozoaires colonisent les fermenteurs digestifs des mammifères herbivores et de
certains mammifères omnivores. Deux des quinze taxons du règne des protozoaires sont
présents dans les fermenteurs digestifs : les Ciliophora (ou ciliés) et les Metamonada
(organismes flagellés des tubes digestifs). Les protozoaires des fermenteurs digestifs sont tous
des organismes anaérobies stricts. De nombreux travaux réalisés sur animaux gnotobiotiques8
démontrent que la défaunation9 n’entraine pas de conséquences pathologiques sur l’hôte
(Fonty et al., 1995; Jouany, 1991). L’implantation des protozoaires dans le rumen ne peut se
faire que par contact direct (salive) ou très proche avec un animal conventionnel, possédant
déjà des protozoaires (Coleman, 1979).
8
animaux axéniques (sans aucun micro-organisme) ou d'animaux à microbiote contrôlé pour l'étude des
interactions entre l'hôte, sa flore et les aliments qu'ils ingèrent.
9
suppression des protozoaires.
55
Etude bibliographique – Chapitre 2
Figure 8. Cilié holotriche du genre Isotricha (couleur) associé avec des ciliés entodiniomorphes
(gris), flagellés (B), Chytridiomycetes ou champignon anaérobie sur soja (C), moisissures du
genre Penicillium (D) et Aspergillus (E), levure saccharomyces cerevisiae (F).
!
Les ciliés représentent près de la moitié de la biomasse microbienne et leur densité
varie de 104 à 106 organismes.ml-1 (Jouany, 1978 ; Figure 8). Les protozoaires ciliés
participent à la dégradation de la matière organique grâce à leurs enzymes hydrolytiques. On
distingue deux groupes de ciliés dans les fermenteurs digestifs:
• les holotriches avec 2 genres majoritaires : Isotricha sp., Dasytricha sp., (Karnati et
al., 2003; Williams & Coleman, 1997) et deux genres minoritaires : Buetschlia sp.,
Charonina sp.. La population de ciliés holotriches tend à augmenter avec une ration
riche en sucres solubles (Jouany & Ushida, 1998). La population de ciliés se déplace
au cours de la journée par chimiotactisme et notamment du réticulum au rumen après
l’ingestion de l’aliment (Abe et al., 1981).
• les entodiniomorphes avec 7 genres majoritaires : Entodinium sp. (prédominant ;
Karnati et al., 2003), Diplodinium sp., Eudiplodinium sp., Diploplastron sp.,
Polyplastron sp., Epidinium sp., Ophryoscolex sp., et 7 genres minoritaires : Eodinium
sp., Eremoplastron sp., Ostracodinium sp., Metadinium sp., Enoploplastron sp.,
Elytroplastron sp. et Epiplastron sp. (De Puytorac et al., 1987; Jouany, 1996). Les
entodiniomorphes ont une grande capacité à absorber des particules solides de petites
tailles (grain amidon, cellulose). Ils absorbent aussi continuellement des bactéries.
56
Etude bibliographique – Chapitre 2
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!
Par rapport aux protozoaires ciliés, les protozoaires flagellés sont peu nombreux dans
les fermenteurs digestifs. On distingue quatre espèces : Chilomastix sp., Monocercomonas sp.,
Pentatrichomonas sp., et Tetratrichomonas sp. (De Puytorac et al., 1987). Le rôle des
protozoaires flagellés dans les fermenteurs digestifs reste méconnu.
2
/!'-9 ).%.
Le règne des champignons (Mycota) se rencontre principalement dans les fermenteurs
digestifs des mammifères herbivores. Toutefois, les champignons semblent être absents du
cæcum du lapin (Bennegadi et al., 2003). Ce sont des organismes eucaryotes pluricellulaires à
l’exception des levures qui sont unicellulaires. Parmi les 32 classes d’Eumycota, seulement
trois se retrouvent dans les fermenteurs digestifs : les Chytridiomycetes, Eurotiomycètes et les
Saccharomycetes (Akin & Borneman, 1990 ; Windham & Akin, 1984).
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Les Chytridiomycetes des fermenteurs digestifs, aussi appelés champignons
anaérobies, sont estimés chez les ruminants entre 103 et 104 zoospores/ml10 (McAllister &
Cheng, 1996) suivant le régime alimentaire ou le délai post-prandial (Grenet et al., 1989a;
Grenet et al., 1989b; Orpin, 1977). Bien qu’inférieurs en nombre par rapport aux bactéries et
aux Archaea, ils représentent 8% de la biomasse microbienne (Orpin, 1981). Dans les
fermenteurs digestifs, on retrouve 5 genres : Cæcomyces sp. (monocentrique, 1-2 flagelles),
Neocallimastix sp. (monocentrique, 4-20 flagelles), Pyromyces sp. (monocentrique, 1-4
flagelles), Orpinomyces sp. (polycentrique, multiflagellé) et Anaeromyces sp. (polycentrique,
1 flagelle).
La fonction écologique majeure des champignons anaérobies se situe au niveau de la
dégradation des parois végétales par une action à la fois enzymatique et mécanique (Windham
& Akin, 1984). Les champignons anaérobies sont les premiers micro-organismes à coloniser
les parois végétales dès que celles-ci entrent dans le fermenteur digestif. Ils possèdent des
activités hydrolytiques à l’égard de nombreux polymères structuraux : cellulose,
hémicellulose, pectine etc. Ces enzymes sont produites par les champignons à la fois dans
leurs stades végétatifs et les zoospores. Les champignons exercent aussi une action mécanique
grâce à la fixation de leurs rhizoïdes sur les particules qui fragilise les polymères structuraux
10
Spores biflagellées mobiles dans l'eau et caractéristiques des Oomycètes
57
Etude bibliographique – Chapitre 2
(Fonty et al., 1999). La fixation des rhizoïdes dans les polymères structuraux est profonde et
tenace (Figure 9). Cette fragilisation permet d’ouvrir des « brèches » par lesquelles les
bactéries accèdent aux tissus sous jacents (Figure 9). Cette potentialité les fait souvent
qualifier par les écologues d’ « organismes ingénieurs ». Ils se fixent préférentiellement sur
les tissus lignifiés (Akin, 1994).
Figure 9. Fragilisation des polymères végétaux par un champignon.
D’après Jarrige et al. (1995a ; photo de E. Grenet)
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Les 2 genres d’Eurotiomycètes, également appelés moisissures, que l’on rencontre
dans les fermenteurs digestifs font partie du genre Penicillium sp. et Aspergillus sp. Peu de
travaux ont été consacrés à leurs études. Elles sont généralement considérées comme des
organismes allochtones en transit, apportés par les aliments (Fonty & Chaucheyras-Durand,
2008c).
.
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La classe des Saccharomycetes comporte un genre unique d’organismes unicellulaires
Saccharomyces sp. communément appelés « levures ». Plusieurs espèces de levures ont été
observées dans les fermenteurs digestifs mais leur rôle au sein de ces écosystèmes demeure
inconnu. Leur caractère aérobie laisse supposer qu’ils sont négligeables. Chez de nombreux
mammifères herbivores, ces micro-organismes seraient allochtones et donc apportés par
l’alimentation en transit (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008c).
Seule l’existence d’entités biologiques de type virale a été mise en évidence dans les
fermenteurs digestifs (Klieve & Swain, 1993; Paynter et al., 1969; Zhang et al., 2006). Ces
virus semblent être essentiellement des bactériophages. Ils pourraient donc jouer un rôle
58
Etude bibliographique – Chapitre 2
important dans la régulation des communautés bactériennes comme cela a été observé en
milieu aquatique (Bettarel et al., 2004). Cette capacité de lyse a été mise en évidence dans le
rumen sur les bactéries cellulolytiques (Klieve et al., 2004). Vingt six types morphologiques
de virus ont été observés (Klieve & Bauchop, 1988 ; Figure 10). Leur concentration est
estimée à 109-1010 phages ml-1 de contenu ruminal (Klieve & Swain, 1993). A notre
connaissance, aucune étude ne s’est attachée à mettre en évidence des virus dans le cæcum du
lapin.
Figure 10. Morphotypes viraux du rumen.
D'après Klieve et Bauchop (1988)
L'espèce constitue l'unité de base de la classification des êtres vivants. La définition
actuellement reconnue de l’espèce est celle formulée par Ernst Mayr (1963). « une espèce
biologique se définit comme une communauté d'êtres vivants reconnaissables par leurs
caractères et capables de se reproduire sexuellement entre eux en donnant naissance à une
progéniture
fertile. »
Cette définition
relativement
bien
adaptée
aux
organismes
pluricellulaires est beaucoup moins applicable pour les organismes unicellulaires. En effet, la
simplicité morphologique des bactéries rend leur distinction difficile sur ces critères. De plus,
ces organismes sont asexués, et leurs capacités de transfert horizontal des gènes ne permet pas
de les distinguer sur des critères reproductifs ou de brassage génétique supposés par la
définition de l’espèce.
59
Etude bibliographique – Chapitre 2
En microbiologie, on préfère utiliser le terme d’ « espèce génomique »
(genomospecies en anglais) proposé par Brenner et al. (Brenner et al., 1993). Cependant, pour
des raisons techniques, on parle plus souvent d’OTU (Operational Taxonomic Unit) ou
d’espèce moléculaire. Cette définition est issue de l’étude presque systématique de l’ADN
microbien. L’OTU désigne un groupe de séquences d’acide nucléique, alignées par position
nucléotidique homologue, dont le pourcentage de similarité deux à deux est supérieur à 97%.
L’OTU peut être affiliée à une espèce cultivée ou non. Toutefois, lorsqu’un OTU est non
affilié à une espèce connue, il est plus souvent appelé « phylotype ».
Les micro-organismes présents dans les fermenteurs digestifs sont sélectionnés par
leur environnement. Chaque espèce de micro-organismes possède ses caractéristiques
physiologiques propres. Si les paramètres du milieu (notion de filtre écologique) dans lesquels
ils vivent satisfont toutes ces caractéristiques (contraintes écologiques), alors les espèces
microbiennes pourront se développer et inversement (Begon et al., 1996). Aussi, les
paramètres du milieu n’agissent pas uniquement sur l’occurrence des espèces microbiennes
mais aussi sur leur activité, leur taux de multiplication, leur physiologie et leur mode de vie.
Comme évoqué précédemment, les fermenteurs digestifs ne constituent pas un milieu
uniforme et de ce fait les paramètres de l’environnement varient en fonction de l’endroit
(localisation) et du temps (transit etc.). Ces micro-environnements fournissent autant de
niches écologiques dans l’espace et le temps qui peuvent être favorables à certaines espèces
microbiennes et défavorables à d’autres. Aussi, par rétroaction, l’activité microbienne peut
participer à la sélection microbienne dans les fermenteurs digestifs. En effet, l’activité
microbienne aboutit à l’utilisation des ressources et à la formation de nouvelles molécules qui
peuvent à leur tour jouer un rôle dans la sélection microbienne (Fonty & ChaucheyrasDurand, 2008a).
Les facteurs physico-chimiques qui jouent un rôle majeur dans la sélection des microorganismes dans un écosystème microbien sont la température, l’humidité, le pH, le potentiel
d’oxydoréduction et l’osmolarité. C’est la raison pour laquelle, au cours de ce travail, nous
avons systématiquement mesuré l’humidité, le pH et le potentiel redox. La température étant
relativement constante dans les écosystèmes digestifs des animaux homéothermes.
60
Etude bibliographique – Chapitre 2
Les fermenteurs digestifs sont des écosystèmes ouverts dans le sens où l’intrant des
ressources est un phénomène régulier, lié à l’ingestion de l’individu hôte. Aussi, la nature des
ressources et leur fréquence d’arrivée dans les fermenteurs digestifs sont des paramètres
capitaux qui peuvent influencer le microbiote. Ces deux paramètres sont plus variables dans
les fermenteurs pré-stomacaux (cas des ruminants) que dans les fermenteurs distaux. En effet,
dans ce dernier cas, le tractus digestif amont régule la nature et la fréquence des intrants.
Comme évoqué précédemment, la nature de l’intrant dans le fermenteur digestif varie
en fonction de la nature de l’aliment et de la position du fermenteur au sein du tractus digestif.
Le bol alimentaire arrivant dans le fermenteur des herbivores est constitué : i) de parois
végétales, ii) de constituants intracellulaires des végétaux, iii) d’amidon, iv) et dans une
moindre mesure ou dans des cas particuliers de chitine, de constituants de produits carnés, de
substrats d’origine endogène (Jarrige et al., 1995b ; Figure 11).
Cellulose
Polyosides
Parois végétales
Glycoprotéines
Hémicellulose
Pectine
Lignines
Amidon
Constituants
intracellulaires
des végétaux
Ose et osides intracellulaires
Constituants azotés
Lipides
Substrats endogène
Autres : pigments, hétéropolyosides
Figure 11. Les différents composants du bol alimentaire entrant dans le fermenteur digestif des
mammifères herbivores.
61
Etude bibliographique – Chapitre 2
ADL 3
ADF 3
Fibres
totales
TDF 1
Fibres
insolubles
WICW 2
NDF 3
Lignine
Cellulose
brute 4
Cellulose
Hémicellulose
Substances
pectiques
Polysaccharides
solubles
/ 0
0
Figure 12. Méthode de dosage des fibres végétales et nature du résidu d’analyse.
D'après Gidenne (1996); 1 TDF=Total Dietary Fiber (Lee et al., 1992) ; 2 Water Insoluble Cell-Wall
(Carré & Brillouet, 1989) ; 3 NDF = Neutral Detergent Fiber, ADF = Acid Detergent Fiber, ADL =
Acid Detergent Lignin (Van Soest et al., 1991) ; 4 selon Weende
Les polyosides sont les principaux constituants des parois végétales (Figure 12). Leurs
teneurs respectives varient fortement selon l’espèce botanique, l’âge de la plante, les organes
de la plante et la qualité du sol. La cellulose structure les parois végétales et de ce fait, elle est
très résistante aux dégradations chimiques et enzymatiques (Moore & Jung, 2001).
L’hémicelluloses donne de la flexibilité et de la plasticité aux parois végétales. Elle est plus
facile à hydrolyser que la cellulose. Les graminées contiennent plus d’hémicellulose que les
légumineuses. Les lignines sont de très grosses molécules, complexes, extrêmement
résistantes à de nombreux agents chimiques et biochimiques. Elles constituent le principal
obstacle à la disponibilité des glucides pour les micro-organismes. La concentration en lignine
est plus élevée dans les tiges que dans les feuilles et augmente avec l’âge de la plante (Jarrige
et al., 1995b). Elle constitue 10 à 15% de la matière sèche des parois végétales. Les oses et les
osides intracellulaires sont principalement présents dans les cellules des parties aériennes des
plantes et dans les organes de réserve (Jarrige et al., 1995b).
Les substances azotées sont principalement localisées dans la partie aérienne des
plantes, la RubisCO représentant 30 à 80% des protéines solubles chez les plantes C311
(Huffaker, 1982). La teneur en azote des plantes diminue au cours de leur croissance et elle
devient inférieure à 1% dans les pailles de monocotylédones.
11
Plantes produisant de l’acide posphoglycéridique à 3 atomes de carbonne lors du cycle de Calvin.
62
Etude bibliographique – Chapitre 2
L’amidon représente la première ressource énergétique d’origine glucidique.
L’amidon se retrouve dans les grains et graines (de 40 à 90%) mais aussi dans les tissus de
stockage des plantes (2 à 4% ; Jarrige et al., 1995b).
Les écosystèmes microbiens digestifs présentent des paramètres environnementaux
particuliers qui constituent des contraintes écologiques majeures pour les micro-organismes :
•
une absence d’énergie lumineuse
•
une forte anaérobiose
•
une température constante et relativement élevée 37-40°C
•
un potentiel d’oxydoréduction très bas : -0.15 à -0.25 V
•
un pH légèrement acide à neutre : pH=5 à 7
63
Etude bibliographique – Chapitre 2
Tableau 7. Paramètres physico-chimiques du rumen et du cæcum du lapin
Rumen
Cæcum lapin
pH
5.7 à 7.3
5.5 à 6.5
Eh
-0.15V à -0.18V
-0.19 à -0.21 V
Température
38 à 41°C
37 à 39
Humidité
82 à 90%
77 à 79%
D’après Clarke et Bauchop (1977) et Marden (2006) pour le rumen et d’après Kimse (2009) pour le
lapin.
Le contenu ruminal et cæcal diffèrent principalement de part (Tableau 7):
•
le couple pH, Eh : De façon générale, l’écosystème cæcal du lapin est plus
acide, plus réducteur et plus anaérobique que le rumen de la vache (Kimsé et
al., 2008; Marden et al., 2005). En revanche, le pH et le potentiel redox du
rumen de la vache est variable au cours de la journée et notamment en fonction
des cycles prandiaux (Marden et al., 2005).
•
L’humidité. Le contenu ruminal est relativement liquide (80 à 92%d’humidité),
tandis que le contenu cæcal est assez pâteux (80% d’humidité).
•
la taille des particules. Les particules fibreuses du rumen sont environ 6 fois
plus grossières que celle du cæcum (Uden & Van Soest, 1982).
•
les concentrations en certains nutriments. L’amidon, les glucides rapidement
fermentescibles, les protéines et les lipides sont présents dans le rumen de la
vache car ils proviennent de l’aliment ingéré. En revanche, ces nutriments sont
quasiment absents du cæcum du lapin car ils sont dégradés et absorbés dans la
partie amont du tube digestif (Tableau 8).
64
Etude bibliographique – Chapitre 2
Tableau 8. Composition des fermenteurs digestifs de la vache (rumen) et du lapin (cæcum) ainsi
que de leur feces : bouse pour la vache, crotte, cæcotrophe pour le lapin.
Rumen
Bouse
Cæcotrophe
Crotte dure
80-90% 80%
66%
53%
830
389
426
443
66
ND
69-80
ND
ND
23
ND
4-11
ND
ND
20
ND
7-19
ND
ND
ND
3-6
ND
ND
ND
ND
ND
ND
vache
% eau
82-90%
Taille
moyenne
des 2290
Cæcum
lapin
paticules (µm)
Acides
Ac.
mM
Acétique
Ac.
Propionique
Ac.
Butyrique
Ac. en C4- 2
C6
Ac. lactique <7
Ammoniaque mM
8-9
ND
5-8
ND
ND
Protéine brute % MO
variable
6-40
28
30
17
Lipides
Variable
Peu
Peu présent
Peu présent
Peu présent
Peu présent
Peu présent
Peu présent
14-56
17
18
30
Toujours
7-30%
12-16% MS
ND
ND
présentes
MO
ordre
de présent
grandeur
Glucides G. solubles
Absent
3h Peu
postprandial présent
Cellulose
brute
Toujours
% présentes
MO
Minéraux
D’après Carabaño et al., 1988, Clarke & Bauchop, 1977, Fraga et al., 1991, Jarrige, 1966, Uden &
Van Soest, 1982. ND. Non déterminé.
On remarque également que les concentrations en AGV sont proches. Cependant, la
quantité d’acide propionique est supérieure à celle d’acide butyrique chez les ruminants alors
que ces proportions sont inversées chez le lapin adulte (Adjiri et al., 1992; Adjiri et al., 1995).
65
Etude bibliographique – Chapitre 2
Chez le lapin, la composition du contenu cæcal est très proche de celle des
cæcotrophes. En revanche, les crottes présentent des teneurs en cellulose plus élevées mais
des teneurs en protéine moins élevées que le contenu cæcal. Ces observations sont en accord
avec la physiologie digestive du lapin, puisque les cæcotrophes correspondent à du contenu
cæcal peu modifié et excrété alors que les crottes correspondent aux grosses particules du
contenu cæcal triées et excrétées (De Blas & Wiseman, 1998).
Le fermenteur digestif est un écosystème composé d’un ensemble de microorganismes (le microbiote) exploitant un milieu donné (le biotope). Cette exploitation du
milieu ne se fait pas de façon aléatoire et anarchique mais est rigoureusement structurée. Cette
auto-organisation est à la fois spatiale, temporelle et fonctionnelle.
. 91'/ * 1 (/% A B-
Les fermenteurs digestifs des mammifères herbivores sont stériles à la naissance, c'està-dire qu’ils n’abritent aucun micro-organisme. La colonisation de l’écosystème va se réaliser
par l’arrivée progressive de différentes communautés de micro-organismes avec une
succession bien définie (Fonty et al., 1987 ; Krause et al., 2000 ; Stewart & Bryant, 1988). En
se développant, l’écosystème se complexifie pour acquérir des propriétés nouvelles jusqu’à un
état ultime appelé climax.
2
1 -'?
(3+ 1 #" *A.'- 3+
L’état climacique (ou climax) correspond à un état d’équilibre dynamique des
communautés microbiennes. En effet, cet équilibre résulte d’ajustements incessants en
réponse aux oscillations, elles-mêmes incessantes, des communautés microbiennes qui le
constituent. Cet état climacique traduit donc un état pour lequel l’écosystème est capable de
s’autoréguler grâce à sa diversité pour maintenir ses fonctions. Du fait, des ajustements
incessants des communautés microbiennes, on ne peut donc qualifier un écosystème de stable
(Lévèque, 2001; Peters, 1991).
66
Etude bibliographique – Chapitre 2
4
(9%.
'+? 9 " +"#' %.
Un intérêt croissant est porté sur la « résistance » des écosystèmes aux perturbations
induites par des facteurs anthropiques (Lévèque, 2001). Chez la vache, comme chez le lapin,
les perturbations étudiées ont concernées le ratio amidon/fibres de la ration (Badiola et al.,
2005; Tajima et al., 2000), l’ajouter de probiotiques (Brossard et al., 2006; Kimse, 2009), ou
d’antibiotiques (Abecia et al., 2007; Edwards et al., 2005) ou encore l’inoculation de
pathogènes (Dewrée et al., 2007). En réponse ces perturbations, l’écosystème peut alors (Ives
& Carpenter, 2007) :
• rester constant, c'est-à-dire ne pas répondre (ou de façon modéré) aux perturbations.
On parle alors de résistance, de persistance, de rémanence ou d’inertie de
l’écosystème.
• Etre affecté par la perturbation mais retrouver son état initial. On parle alors de
résilience ou d’homéostasie de l’écosystème. On étudie alors l’ampleur de la réponse à
la perturbation en caractérisant i) l’amplitude des modifications sur la structure de
l’écosystème et ii) son élasticité, c'est-à-dire la vitesse à laquelle il revient à son état
initial.
• Etre affecté par la perturbation et ne pas retrouver son état initial. On parle alors de
seuil de réversibilité pour étudier les limites de la capacité de réaction de
l’écosystème.
Les perturbations ont un rôle structurant dans le maintien de l’écosystème en affectant
les dynamiques des communautés microbiennes. Le postulat veut qu’un écosystème soit
d’autant plus stable qu’il est diversifié notamment en raison de la redondance fonctionnelle et
de l’occupation maximale de toutes les niches. Cette théorie repose sur le fait que de
nombreuses espèces de micro-organismes sont capables de réaliser les mêmes fonctions au
sein de l’écosystème (Cardinale et al., 2002). Ainsi, la disparition d’une espèce microbienne
n’affectera pas le fonctionnement de l’écosystème étant donné que d’autres espèces
microbiennes peuvent remplir les fonctions qu’elle occupait. Ainsi sur les écosystèmes
digestifs, les travaux de Fonty et al. (Fonty & Gouet, 1989; Fonty et al., 1983a; Fonty et al.,
1983b) ont démontré l’effet positif d’une plus grande diversité biologique sur le
fonctionnement des fermenteurs digestifs.
67
Etude bibliographique – Chapitre 2
Dans les fermenteurs digestifs, les micro-organismes ne sont pas distribués de façon
homogène et uniforme mais au contraire se répartissent dans l’espace de façon structurée en
fonction des conditions écologiques. A notre connaissance, aucune étude n’a été réalisée sur
la structuration spatiale dans le cæcum du lapin. En revanche, de nombreuses études ont été
réalisées sur la structuration spatiale des communautés microbiennes dans le rumen des
herbivores.
Les communautés microbiennes de la phase solide et liquide du rumen sont différentes
(Tableau 9). Les communautés bactériennes de la phase solide contiennent plus de Firmicutes
et de Proteobacteria (Cho et al., 2006; Larue et al., 2005; Tajima et al., 1999). En revanche,
les communautés bactériennes de la phase solide contiennent plus de Bacteroidetes. Ces
résultats sont observés chez la vache (Cho et al., 2006; Tajima et al., 1999) et chez le mouton
(Larue et al., 2005) quel que soit le régime alimentaire. Shin et al. (2004) démontrent
également que la communauté de protozoaires diffère entre les phases liquide et solide du
contenu ruminal notamment avec une absence du genre Epidinium dans la phase solide.
Les communautés microbiennes de la lumière du rumen (phase solide et liquide, dite
luminale) diffèrent de celle de la paroi ruminale (dite épimurale ; Cho et al., 2006; Sadet et
al., 2007). Les communautés bactériennes épimurales sont composées respectivement de 6 à
12 fois plus de Firmicutes et de 0.3 à 8 fois moins de Bacteroidetes que les communautés
bactériennes luminales (Cho et al., 2006 ; Sadet et al., 2007). De plus, les protozoaires,
abondant dans la lumière du rumen, sont absents de l’épithélium ruminal (Shin et al., 2004).
68
Etude bibliographique – Chapitre 2
Tableau 9. Les différentes divisions bactériennes présentes dans la phase liquide, solide et dans l’épithélium du rumen.
Hôte
Régime alimentaire
Localisation
dans le rumen n
en % du nombre total de sequence
Firmicutes
Référence
Bacteroidetes Spirochaetes Proteobacteria
(Whitford et al.,
1998)
(Kocherginskaya et
al., 2001)
Vache
65% foin / 35% concentré
tarie
phase liquide
53
11
79
0
8
bœuf
foin de luzerne
phase liquide
68
25
68
4
3
20% foin / 80% concentré
phase liquide
67
15
58
0
27
phase liquide
51
90
4
2
4
phase liquide
phase liquide
58
41
72
95
22
2
0
0
5
0
phase liquide
41
49
39
2
5
phase solide 42
phase solide 48
phase solide 43
phase liquide 98
phase solide 157
phase liquide 120
phase solide 134
69
42
47
57
70
54
73
29
54
30
40
25
41
25
2
0
19
0
0
0
0
0
2
2
3
0
1
1
(Larue et al., 2005)
phase liquide
40
30
68
0
3
(Cho et al., 2006)
phase solide
épithélium
phase solide
37
36
76
6
57
11
94
36
3
0
0
5
0
3
(Yu et al., 2006)
Vache
75% luzerne / 25% concentré
tarie
Passage de 25 à 92% concentré
92% concentré
Vache 80% luzerne-fléole / 20% de
tarie
concentré
mouton foin d'herbe
80% luzerne / 20% concentré
mouton foin d'herbe
70% foin d'herbe / 30% maïs
Vache 75% enveloppe de riz / 25%
tarie
concentré
mouton foin d'herbe
(Tajima et al., 2000)
(Tajima et al., 1999)
(Koike et al., 2003b)
n : nombre total de séqence
.
69
Etude bibliographique – Chapitre 2
5
5
Malgré la grande diversité des substrats d’origine glucidique entrant dans les fermenteurs
digestifs, le catabolisme des glucides par les micro-organismes est relativement simple. La dégradation
des polymères végétaux s’organise autour de 3 étapes successives : l’hydrolyse, la fermentation et
l’hydrogénotrophie.
70
Etude bibliographique – Chapitre 2
Figure 13. Principales voies métaboliques des glucides dans les fermenteurs digestifs.
D’après Fonty et Chaucheyras-Durand (2008b).
71
Etude bibliographique – Chapitre 2
A*"%1A
*
9%1A-B"
$()( '+? /%-91 ?
L’hydrolyse transforme les polymères végétaux complexes en oses simples12. Bien que les
polymères végétaux arrivant dans le fermenteur digestif soient par nature extrêmement variés, leur
hydrolyse aboutit majoritairement à la formation de glucose et de xylulose (Figure 13). L’hydrolyse est
un mécanisme enzymatique qui permet de rompre les liaisons entre les oses simples qui composent les
polymères complexes. A titre d’exemple, comme la cellulose est constituée d’un assemblage de centaines
de molécules de glucose liées par des liaisons glycosidiques, l’hydrolyse de la cellulose aboutie à la
production de glucose par rupture des liaisons glycosidiques.
2
"- . ' %. *
%
-91
La fermentation transforme les oses simples issus de l’hydrolyse en acides gras volatils (ou AGV ;
Figure 13). La fermentation se réalise en deux étapes consécutives : la transformation des oses simples en
acide pyruvique suivie d’une transformation de l’acide pyruvique en acides gras à chaine courte. L’acide
pyruvique est un métabolite central des processus fermentaires.
La première étape permet de transformer les oses simples composés de 5 à 6 atomes de carbone en
une molécule intermédiaire, l’acide pyruvique, composé de 3 atomes de carbone. Bien que 4 voies
métaboliques existent dans la nature pour réaliser cette transformation, deux opèrent dans les fermenteurs
digestifs :
•
La glycolyse (ou voie de Embden-Meyerhof-Parnas). Dans les fermenteurs digestifs, cette
voie est utilisée par la majorité des microorganismes, à l’exception des Bifidobactéries
(Wolin & Miller, 1983). Cette réaction13 nécessite du glucose et produit, 2 pyruvates pour
une consommation de 2 ATP, par unité de glucose.
•
La voie des pentoses phosphates (ou voie de Warburg-Dickens-Horecker). Cette voie
minoritaire intervient principalement dans le métabolisme des pentoses14 qui sont issus
majoritairement de l’hydrolyse de l’hémicellulose et des pectines.
La deuxième étape de la fermentation transforme l’acide pyruvique en AGV.
Dans les
fermenteurs digestifs, l’acide pyruvique est converti selon 3 voies métaboliques majoritaires qui
conduisent à la formation d’acide acétique, d’acide propionique et d’acide butyrique qui sont absorbés au
niveau de l’épithélium de l’hôte puis utilisés par le métabolisme général. D’autres voies métaboliques
présentes mais minoritaires existent et aboutissent à la production d’acide succinique, d’acide lactique et
d’éthanol. En revanche, les acides lactiques, succiniques et l’éthanol ne sont pas absorbés par l’épithélium
12
Un ose simple est une chaine de 3 à 8 carbones hydrogénée et oxygénée ne comportant pas de liaison osidique. C’est l’unité
fondamentale des glucides
13
Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 Pyruvate + 2 ATP + 2 (NADH,H+) + 2 H2O
14
Molécule à 5 atomes de carbone dont la xylose est majoritaire dans les fermenteurs digestifs
72
Etude bibliographique – Chapitre 2
de l’hôte. Pour autant, ils ne s’accumulent pas dans le fermenteur digestif car ils sont à leur tour
métabolisés par les micro-organismes.
La contribution des AGV à la nutrition de l’hôte varie selon les espèces animales. Chez les
ruminants, la proportion des différents AGV produits dans le rumen varie en fonction du régime
alimentaire de l’hôte. D’une manière générale, un aliment riche en cellulose conduit à une production
majoritaire d’acide acétique alors qu’une ration riche en amidon aboutie à une augmentation de la
proportion en acide propionique (Andersen et al., 1999). Chez les ruminants, ces AGV contribuent à:
•
la nutrition directe de l’hôte par leur absorption au niveau de l’épithélium réticulo-ruminal. Chez
une vache adulte de 600kg absorbant 18kg de matière organique par jour, environ 9kg de matière
oganique sont fermentés. Pour des proportions en AGV standards (65% d’acide acétique, 25%
d’acide propionique et 10% d’acide butyrique), cela représente une production journalière de
3.5kg d’acide acétique, 1.7kg d’acide propionique, 0.8kg d’acide butyrique, 535 l de méthane et
1187 l de dioxyde de carbone (Jouany et al., 1995). Les 535 l de méthane éructés constituent donc
une perte d’énergie énorme, de l’ordre de 8 à 12 % de l’énergie disponible dans la ration (Hooper
et al., 2002; Martin et al., 2006; Moss et al., 2000; Vermorel, 1995).
•
la nutrition indirecte de l’hôte par digestion des micro-organismes du fermenteur. En effet, les
fermentations productrices d’AGV sont réalisées par les micro-organismes. L’apport d’aliment
dans le fermenteur conduit donc à une prolifération microbienne. Le rendement de cette synthèse
de micro-organismes est estimé à 53 g de micro-organismes par kg de matière organique
fermentée (Jouany et al., 1995). Chez une vache adulte de 600kg absorbant 18kg de matière
organique, cela représente 477g de biomasse microbienne par jour. Cette biomasse, digérée dans
l’estomac, est absorbée dans l’intestin et contribue donc à l’alimentation de l’hôte (cf. Etude
bibliographique- Chapitre 1).
•
au développement des papilles de l’épithélium ruminal. L’acide butyrique joue un rôle
prépondérant dans le développement épithélial (Hooper, 2004).
Chez le lapin, les AGV contribuent à la nutrition de l’hôte uniquement par leur absorption au
niveau la paroi cæcale. Les proportions relatives des différents AGV sont influencées par l’âge (Bellier et
al., 1995; Padilha et al., 1995), le régime alimentaire (Gidenne, 1997) et le statut sanitaire (BennegadiLaurent et al., 2004) du lapin. Le ratio acide propionique/acide butyrique est supérieur à 1 avant le
sevrage comme chez les ruminants jeunes et adultes. Ce ratio devient inférieur à 1 après le sevrage (Adjiri
et al., 1992; Adjiri et al., 1995). Chez le lapin, comme chez les ruminants, la composition du mélange
d’AGV dépend de la composition de la ration. Une ration riche en matière fibreuse entraine une
augmentation de la concentration cæcal en acide acétique et une diminution de la concentraton en acide
73
Etude bibliographique – Chapitre 2
propionique (Gidenne, 1997). Chez le lapin, la production des AGV couvre 30% de l’énergie de
maintenance de l’hôte (Hume, 1997).
4
*"%)(.% "%9!
Tableau 10. Les voies d’hydrogénotrophie
Micro-organismes
Réactions
G°’
(kJ/H2 consommé)
Bactéries sulfato-
4H2 + SO42- + H+ -> HS- + 4H2O
-38
réductrices
Archaea méthanogène 4H2 + HCO3- + H+ -> CH4 + 3H20
Bactéries acétogènes
4H2 + 2HCO3- + H+ -> CH3COO- + 4H2O
-33.9
-26.2
D’après Fonty et al. (2007).
Toutes les réactions fermentaires se déroulant dans les compartiments digestifs produisent de
grandes quantités de dioxyde de carbone et de dihydrogène. Le dihydrogène ne s’accumule pas dans le
fermenteur digestif car, dès sa production, il est utilisé par les micro-organismes hydrogénotrophes qui
sont au contact des micro-organismes fermentaires. Dans les écosystèmes anaérobies, trois voies
métaboliques utilisent le dihydrogène comme accepteur d’électrons : la sulfato-réduction, la
méthanogenèse et l’acétogenèse (Tableau 10). La sulfato-réduction est la réaction thermodynamiquement
la plus favorable. Cependant, dans les fermenteurs digestifs, elle reste minoritaire en raison de la faible
concentration en sulfate. La méthanogenèse et, dans une moindre mesure l’acétogenèse, sont les deux
voies d’hydrogénotrophie que l’on rencontre dans les fermenteurs digestifs. La méthanogenèse est la voie
principalement utilisée dans les fermenteurs digestifs, si les micro-organismes capables d’utiliser cette
voie sont présents, car le dioxyde de dioxyde de carbone est abondant, et cette réaction nécessite moins
d’énergie que l’acétogenèse réductrice. La méthanogenèse est exclusivement réalisée par les Archaea
(Jones et al., 1987) tandis que l’acétogenèse est réalisée par de nombreux phyla bactériens. Or, la
présence des Archaea dans le fermenteur digestif dépend de l’espèce animale et aussi chez certaines
espèces de chaque individu. Chez les ruminants, les Archaea sont toujours présentes et de ce fait la
méthanogenèse est la voie d’hydrogénotrophie majoritaire. Chez le lapin, des études in vivo et in vitro sur
l’émission de méthane montrent que la production de méthane est très variable selon les individus
(Belenguer et al., 2008; Marounek et al., 1999; Piattoni et al., 1996). Ces résultats suggèrent que chez les
individus faiblement producteurs de méthane, une autre voie métabolique d’hydrogénotrophie est
préférentiellement utilisée, comme l’acétogenèse réductrice déjà mise en évidence chez les rongeurs
(Prins & Lankhorst, 1977). L’acétogenèse réductrice est systématiquement majoritaire dans le fermenteur
stomacal du kangourou (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008b). Chez l’homme, le fermenteur (côlon)
utilise soit l’acétogenèse soit la méthanogenèse comme voie d’hydrogénotrophie principale
74
Etude bibliographique – Chapitre 2
respectivement chez les sujets non méthano-excréteurs et méthano-excréteurs (Bernalier et al., 1996a;
Bernalier et al., 1996b). Dans la population humaine, la moitié des individus serait méthano-excréteur
dont les deux tiers seraient des femmes (Doré et al., 1995; El Oufir et al., 1996; Pochart et al., 1993). La
présence des Archaea méthanogènes serait davantage liée à des effets environnementaux qu’à des
phénomènes génétiques et héréditaires. En effet, la cohabitation en cage commune de rats non méthanoexcréteurs et méthano-excréteurs engendre une conversion de l’hydrogénotrophie vers la méthanogenèse
chez la majorité des individus non méthano-excréteurs (Florin et al., 2000).
Certaines espèces bactériennes et fongiques du rumen sont capables in vitro de solubiliser des
monomères simples de la lignine (Besle et al., 1995). Cependant, la lignine n’est pas ou peu dégradée
dans les fermenteurs digestifs in vivo (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008b). En effet, son hydrolyse
requiert un mécanisme d’oxydation thermodynamiquement non réalisable dans un milieu anaérobie. Par
conséquent, la lignine est un obstacle majeur à l’accès des micro-organismes aux tissus dégradables sousjacents des végétaux (cellulose, hémicellulose, amidon). Cependant, certains mammifères herbivores ont
développé des stratégies adaptatives, comme la rumination, pour détourner cet obstacle.
Les protéines contenues dans les aliments sont dégradées par les micro-organismes lorsque le
fermenteur digestif est situé en amont du tractus gastro-intestinal. Inversement, chez les espèces dont le
fermenteur se situe en aval du tractus gastro-intestinal, comme le lapin, les protéines sont digérées
préalablement par l’équipement enzymatique de l’hôte, dans la partie proximale du tractus digestif,
principalement l’estomac et l’intestin grêle. Chez l’homme, seulement 10% des protéines ingérées
arrivent au fermenteur digestif : le côlon (Cuillerier & Marteau, 2002). Ces protéines sont issues de
l’alimentation (non dégradées préalablement) ou sont d’origine endogène.
Dans les fermenteurs digestifs, la protéolyse est due aux bactéries et aux protozoaires. 30% à 50%
des bactéries isolées du rumen sont capables de lyser les protéines solubles (Wallace et al., 1997). La
particularité des protozoaires est qu’ils lysent essentiellement les protéines insolubles (Ushida & Jouany,
1985). Les enzymes protéolytiques, présentes dans le périplasme15 des micro-organismes, sont sécrétées à
la surface des cellules où la protéolyse opère.
15
Espace cellulaire situé entre la membrane cytoplasmique (interne) et la membrane externe
75
Etude bibliographique – Chapitre 2
Protéine
Polypeptide
Oligopeptide
Tri- et di-peptide
Acides aminés
Résidus carbonés
Facteurs de
croissance des
bactéries
cellulolytiques
•Divers
•Acide isovalérique
•Acide 2-méthylbutyrique
•Acide isobutyrique)
Incorporés dans les
protéines
microbiennes
+
Ammoniaque
Figure 14. Dégradation des protéines dans les fermenteurs digestifs
D’après Cotta et Hespell (1986).
La dégradation des protéines se fait en étapes successives ; chaque réaction n permettant de
réduire la taille du peptide utilisé dans la réaction n-1 (Figure 14). Ainsi, la taille des polypeptides
diminue au cours des lyses jusqu’au stade tripeptide, dipeptide, voire jusqu’en acide aminé libre. Les
acides aminés sont alors soit désaminés par des espèces bactériennes spécifiques (Wallace et al., 1997),
soit directement incorporés par les micro-organismes pour former leurs propres protéines. La
désamination conduit à la formation de corps carbonés résiduels et d’ammoniaque. La désamination de
certains acides aminés ramifiés comme la leucine, l’isoleucine et la valine conduit à la formation d’acides
gras ramifiés: respectivement, l’acide isovalérique, l’acide 2-méthylbutyrique et l’acide isobutyrique. Ces
acides aminés sont d’une importance capitale car ils servent de facteurs de croissances aux bactéries
cellulolytiques (Bryant & Robinson, 1963).
Les micro-organismes utilisent préférentiellement l’ammoniaque aux acides aminés libres comme
source d’azote (Jouany et al., 1995). Si la production d’ammoniaque est supérieure aux besoins des
micro-organismes, le surplus est absorbé au niveau de la paroi ruminale, circule dans le sang sous forme
d’urée et est éliminé principalement dans l’urine (Leng & Nolan, 1984). Chez l’homme l’ammoniaque en
surplus altère la physiologie des cellules épithéliales du côlon et jouerait ainsi un rôle dans les
mécanismes d’initiation du cancer colique (Bernalier-Donadille, 2004).
76
Etude bibliographique – Chapitre 2
Les lipides qui arrivent dans le fermenteur digestif sont essentiellement sous forme de
glycolipides, phospholipides et triglycérides. Les lipides sont essentiellement dégradés chez les animaux
dont le fermenteur est localisé en amont du tube digestif puisque dans le cas des fermenteurs localisés en
aval du tractus digestif, les lipides sont dégradés et absorbés dans l’estomac et l’intestin grêle.
"- . +" . 9%
%. '. (" +" & 1 /' * 1' $'/!
Les molécules lipidiques sont dégradées par hydrolyse grâce aux bactéries lipolytiques. De ces
hydrolyses résultent des acides gras qui vont alors subir des transformations très diverses par d’autres
micro-organismes. Dans le rumen, les principales transformations des acides gras sont : l’isomérisation16,
l’hydrogénation17 et l’hydratation (Vossenberg & Joblin, 2003). 80% à 92% des acides linoléiques et
linoléniques sont hydrogénés dans le rumen (Doreau & Ferlay, 1994). Ces acides gras saturés sont ensuite
digérés grâce aux enzymes pancréatiques dans l’intestin grêle puis absorbés.
Le degré de saturation des acides gras a des conséquences directes sur la nutrition et la santé de
l’hôte. En effet, il a été montré, chez l’Homme, que les acides gras saturés (acide laurique, myristique et
palmitique) ont un rôle pro-carcinogène et pro-athérogène18 (Williams, 2000) alors que les insaturés
(acide oléique, polyinsaturés oméga-3) ont un rôle anti-carcinogène et anti-athérogène (Williams, 2000).
Par conséquent, les facteurs alimentaires susceptibles d’orienter le métabolisme des lipides dans les
fermenteurs digestifs vers une production d’acides gras insaturés au détriment des acides gras saturés sont
largement étudiés depuis quelques années chez l’Homme et les ruminants (Chilliard et al., 2000).
2
"- . +" . 9%
%. 9% (" +" & /' *+ 1'9 .
Bien que le rôle du microbiote cæcal dans la dégradation lipidique soit probablement limité,
certaines espèces microbiennes seraient capables de convertir le cholestérol en coprostanol. Le
coprostanol, peu absorbé, est excrété dans les selles. Chez l’Homme, il a été démontré que les microorganismes capables de réaliser cette bioconversion ne sont pas forcément présents chez tous les
individus (Veiga et al., 2005). A notre connaissance, aucune étude sur ce sujet n’a été réalisée sur le lapin,
ou d’autres animaux à fermenteur digestif postérieur. La teneur en lipides dans l’alimentation des lapins
est généralement faible (entre 2% et 4%). Ceux-ci étant majoritairement absorbés au niveau de l’intestin
grêle, la teneur en lipides qui arrive dans le cæcum est très faible.
16
Conversion d'une molécule d’acide gras en un de ses isomères.
Conversion des acides gras insaturés en acides gras saturés par l’ajout de dihydrogène.
18
qui accélère le processus d'altération dégénérative de la paroi interne des vaisseaux sanguins
17
77
Etude bibliographique – Chapitre 2
Les fonctions globales du microbiote ne sont bien connues que dans quelques fermenteurs
digestifs (côlon humain, rumen). Les capacités métaboliques in vitro de quelques espèces bactériennes
(souvent cultivables) ont été étudiées mais ne permettent pas de réellement juger de leurs aptitudes in
vivo. Nous décrirons ci-après seulement les espèces majoritairement présentes dans le rumen ou celles
ayant un rôle essentiel dans son bon fonctionnement (Tableau 11 ; Figure 15).
Les Ruminococccus font partie des espèces cellulolytiques les plus actives. R. albus et R.
flavefaciens ont été observées chez les ruminants et les équidés (Julliand et al., 1999; Lin & Stahl, 1995).
78
Etude bibliographique – Chapitre 2
Tableau 11. Fonctions in vitro des bactéries cultivables isolées du rumen.
Bacilli
Bacteroidetes
bacteroides
Proteobacteria
Aeromonadales
Spirochaetes
Pasteurellales
Campylobacterales
Desulfuvbriorales
Spirochaetes
+
+
+
+
Sulfatoréd.
+
+
+
Acétog.
+
+
+
Méthanog.
Lactate
Succinate
Ethanol
Isobutyrate
butyrate
Propionate
+
+
+
HGT
CO2
+
+
Acétate
Lactate
Produit de fermentation
Ac. aminés
Pentose
Fructose
Galactose
Glucose
Saccharose
Maltose
Cellobiose
Lipide
+
+
Peptide
+
+
Protéine
+
+
Substrat de fermentation
H2
Ruminococcus albus
Ruminococcus flavefaciens
Ruminococcus bromii
Ruminococcus schinkii
Fibrobacter succinogenes
Butyrivibrio fibrisolvens
Clostridium aerotolerans
Clostridium longisporum
Clostridium aerotolerans
Clostridium aminophilum
Clostridium sticklandii
Clostridium polysaccharolyticum
Eubacterium cellulosolvens
Eubacterium ruminantium
Eubacterium limosum
Eubacterium oxydoreducens
Selenomonas ruminantium
Lachnospira multipara
Lachnobacterium bovis
Mitsuokella jalaludinii
Mitsuokella multiacidus
Anaerovibrio lipolytica
Megasphaera elsdenii
Peptostreptococcus anaerobius
Peptostreptococcus productus
Acidaminococcus fermentans
Allisonella histaminiformans
Veillonella alcalescens
Veillonella parvula
Acetitomaculum ruminis
Succiniclasticum ruminis
Desulfotomaculum ruminis
Streptococcus bovis
Syntrophococcus sucromutans
Prevotella ruminicola
Prevotella bryantii
Prevotella brevis
Prevotella albensis
Ruminobacter amylophilus
Succinomonas amylolytica
Succinivibrio dextrinosolvens
Succinivibrio dextrinosolvens
Mannheimia succiniproducens
Wolinella succinogenes
Desulfovibrio desulfuricans
Treponema bryantii
Treponema saccharophylum
Amidon
Clostridia
Pectine
Firmicutes
Hydrolyse
Hémicellu.
Classe
Cellulose
Division
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
D’après Fonty et Chaucheyras-Durand (2008d). HGT: hydrogénotrophie.
79
Etude bibliographique – Chapitre 2
Pour adhérer aux fibres végétales, ces bactéries forment un épais glycocalyx19 (Roger
et al., 1990). Elles sont très sensibles au pH acide provoqué par une alimentation riche en
amidon. Certaines souches de R. albus produisent des métabolites secondaires qui inhibent R.
flavefaciens (Odenyo et al., 1994) et certains Chytridiomycetes (Bernalier et al., 1993).
Figure 15. Consortium bactérien de différentes espèces sur des fibres végétales (Krause et al.,
2003)
Fibrobacter succinogenes est une espèce cellulolytique majeure du rumen, puisqu’elle
représente 5 à 6% de la communauté procaryotique. Elle est capable de dégrader les celluloses
les plus récalcitrantes mais elle est très sensible aux phénols des végétaux (Chesson et al.,
1982).
Butyrivibrio fibrisolvens est susceptible d’exercer une grande variété de fonctions
(hydrolyses glucidique et protéique, fermentation) bien que son activité cellulolytique soit
plus faible que les Ruminococcus et Fibrobacter succinogenes (Bryant & Burkey, 1953). Elle
fait partie des espèces dominantes chez les ruminants et elle est une des principales espèces
productrices d’acide butyrique.
Les Clostridium ne sont jamais dominantes dans le rumen. Elles sont cellulolytiques,
et certaines espèces dégradent les peptides.
Les Eubacterium ont été isolées chez diverses espèces de mammifères herbivores.
Leurs potentialités métaboliques varient beaucoup d’une espèce à l’autre. Elles sont
principalement
fermentatives.
Certaines
espèces
hydrogénotrophes
sont
capables
d’acétogenèse réductrice.
Selenomonas ruminantium est une espèce majoritaire chez les ruminants recevant un
aliment riche en amidon. Ces bactéries fermentent et produisent de l’acide lactique, de l’acide
19
couche de polyholosides liée aux lipides et aux protéines de la membrane. Il a un rôle dans la protection, un
rôle dans les phénomènes de reconnaissance et d'adhésion cellulaire
80
Etude bibliographique – Chapitre 2
acétique et de l’acide propionique et une faible quantité de dihydrogène dont la concentration
augmente fortement en présence d’Archaea méthanogènes (Scheifinger et al., 1975).
Megasphaera elsdenii fermente les oses simples et 97% du lactate présent dans le
rumen (Counotte et al., 1981). Elle se retrouve chez les jeunes ruminants et chez les
ruminants recevant une ration riche en amidon (Stewart & Bryant, 1988). M. elsdenii produit
également beaucoup d’acides gras ramifiés20 indispensables à la croissance de nombreuses
espèces bactériennes dont les cellulolytiques.
Streptococcus bovis est une espèce amylolytique majoritaire chez les ruminants
recevant une alimentation riche en céréales. La croissance de cette espèce est très rapide
(temps de doublement de la population de l’ordre de 25 minutes) et son activité génère de
grandes quantités d’acide lactique. Par conséquent, S. bovis est l’agent souvent responsable
des phénomènes d’acidose lactique.
Lachnospira multipara est la principale espèce pectinolytique du rumen. On retrouve
cette espèce chez les animaux recevant une alimentation riche en pectine.
Les fonctions métaboliques d’Anaerovibrio lipolytica sont l’hydrolyse des lipides et
l’utilisation de l’acide lactique. Son importance est donc capitale dans le fonctionnement du
fermenteur digestif.
Parmi les Peptostreptococcus, P. anaerobius est une espèce capitale dans le
fonctionnent du rumen puisqu’elle est la principale espèce productrice d’ammoniaque.
Les Prevotella sont des espèces dominantes quel que soit le régime alimentaire des
ruminants. On les retrouve également chez de nombreux animaux non ruminants : Homme,
lapin, porc. Elles remplissent de nombreuses fonctions métaboliques : de l’hydrolyse des
glucides à la fermentation des oses simples, en passant par la protéolyse (Wallace &
Brammall, 1985).
20
Par désamination et décarboxylation
81
Etude bibliographique – Chapitre 2
>
C
Des études basées sur la microscopie électronique ou les colorations de Gram
montrent que les différentes espèces de ruminants ont des similitudes dans leurs microbiotes
(Hobson et al., 1976; Pearson, 1967; Pearson, 1969). Les principales espèces bactériennes
dans le fermenteur digestif des ruminants domestiques se retrouvent chez les ruminants
sauvages que ce soit avec l’utilisation d’approche culturale ou moléculaire (Dehority, 1975;
Dehority, 1986; Nelson et al., 2003; Orpin et al., 1985).
Chez les ruminants domestiques, des travaux par approche culturale démontrent que,
entre ovins et bovins, les espèces bactériennes amylolytiques et hemicellulolytiques sont
proches (Dehority & Grubb, 1976; Leedle & Hespell, 1980). Les études moléculaires
démontrent que certaines divisions bactériennes sont dans les mêmes proportions dans le
rumen de différentes espèces de ruminants domestiques, tandis que chez d’autres divisions les
proportions diffèrent. Par exemple, chez les ovins, le rumen est composé de 42 à 73% de
Firmicutes, 25 à 54% de Bacteroidetes, 0 à 19% de Spirochaetes et 0 à 3% de Proteobacteria.
Chez les bovins, bien que les proportions de Firmicutes et de Bacteroidetes soient similaires,
les Proteobacteria (0 à 27%) sont plus présentes que les Spirochaetes (0 à 4%). Chez le yak
(Bos grunniens), la division des Proteobacteria est absente (An et al., 2005). Chez les caprins,
la densité bactérienne au niveau du contenu ruminal serait plus importante que chez les ovins
(Sultan et al., 2006). Chez la chèvre, le genre Butyrivibrio est majoritaire puisque 70% des
souches isolées appartiennent à cette espèce bactérienne. Cette proportion est plus élevée que
ce qui a déjà pu être observé chez les bovins ou les ovins (Dehority & Grubb, 1976).
Etant donné que les communautés bactériennes des fermenteurs digestifs abritent
plusieurs centaines d’espèces, il est probable que les espèces présentes et leurs abondances
respectives diffèrent, au moins un peu, d’un individu à l’autre chez une même espèce de
mammifère herbivore.
Cette variabilité inter-individu a été observée dans la communauté bactérienne du
rumen du mouton (Edwards et al., 2005), du côlon de l’Homme (Zoetendal et al., 1998), du
côlon du chien (Simpson et al., 2002). L’utilisation de la microscopie électronique démontre
que le nombre de bactéries attachées à la paroi du rumen de la vache variait d’un animal à
82
Etude bibliographique – Chapitre 2
l’autre (McCowan et al., 1980). Dans le rumen du mouton, la variabilité entre individus est
généralement plus importante que les autres effets testés comme un traitement antibiotique
(Edwards et al., 2005) ou un changement alimentaire (Larue et al., 2005). Ainsi Larue et al.
(2005) démontrent que les profils DGGE varient de 40% entre individus. En revanche, cette
variabilité entre individus n’a pas été observée chez certaines espèces comme la dinde
(Scupham, 2007). D’après Zoetendal et al. (1998) des différences inter-individuelles existent
mais sont finalement de faible ampleur chez l’Homme puisque la flore bactérienne dominante
est stable d’un individu à l’autre.
L’alimentation est un facteur essentiel qui influence le microbiote du tube digestif. La
nature, la forme de présentation, la quantité ingérée, la fréquence de distribution sont autant
d’éléments qui peuvent influencer les communautés de micro-organismes. Les effets
alimentaires ont beaucoup été étudiés chez l’Homme et les ruminants, notamment chez ce
dernier en modulant le ratio amidon/fibres.
La communauté bactérienne de la phase liquide, lorsque le régime est riche en
fourrages (100% foin de graminée ou 100% foin de luzerne + graminée), est principalement
composée des divisions des Firmicutes (25 à 57%) puis des Bacteroidetes (40 à 68%), et dans
une faible proportion des Proteobacteria (2 à 3%) et des Spirochaetes (0 à 4% ;
Kocherginskaya et al., 2001; Koike et al., 2003b; Larue et al., 2005; Yu et al., 2006).
Avec un régime riche en concentrés, les Firmicutes deviennent plus largement
majoritaires (92%) tandis que les Bacteroidetes deviennent minoritaires (2% ; Tajima et al.,
2000) et les Proteobacteria et Spirochaetes sont absentes (Koike et al., 2003b; Larue et al.,
2005). Parmi les Firmicutes, la moitié appartiennent aux genres Mitsuokella et Selenomonas
(Tajima et al., 2000). Toujours, parmi les Firmicutes, on observe une augmentation des
bactéries productrices et utilisatrices d’acide lactique (Lactobacillus ruminis, Streptococcus
bovis, Selenomonas ruminantium, Butyrivibrio fibrisolvens et Megasphera elsdenii etc. ;
Tajima et al., 2000) en accord avec les travaux réalisés par culture de Mackie et Gilchrist
(1979). On observe également une augmentation des Ruminococcus amylolytiques (R. bromii,
R. callidus, R. hydrogenotrophicus, R. obeum et R. schinkii ; Larue et al., 2005) et une baisse
des Ruminococcus cellulolytiques (R.albus ; Larue et al., 2005; Van der Linden et al., 1984).
L’activité de ces populations cellulolytiques est fortement diminuée (Martin et al., 2002),
entre autres, en raison de leur sensibilité au pH acide induit par les fermentations rapides
83
Etude bibliographique – Chapitre 2
(Russell & Wilson, 1996). On observe également une augmentation des ciliés holotriches qui
consomment les amidons et les oses et une très nette diminution des entodiniomorphes
(Nagaraja, 2002).
Cependant, la nature même du fourrage ou du concentré utilisé peut modifier les
communautés microbiennes. Par exemple les champignons anaérobies se développent plus
particulièrement avec le foin de luzerne ou de prairie naturelle (Grenet et al., 1989a). De
même, Fibrobacter succinogenes serait favorisé par rapport à Ruminococcus albus et R.
flavefaciens avec des régimes riches en cellulose cristalline (Fonty et al., 1995).
En résumé, le microbiote des fermenteurs digestifs est composé de bactéries,
d’Archaea, d’eucaryotes (protozoaires ciliés, protozoaires flagellés et champignons
anaérobies) et de virus. Ces communautés microbiennes sont capables de dégrader les
polyosides complexes (hydrolyse, fermentation, hydrogénation), les protéines et les
lipides. Les méthodes de culture et plus récemment les outils de biologie moélculaire ont
permis de montrer que ces communautés se structurent dans le temps et dans l’espace.
On observe également une variabilité des écosystèmes digestifs entre espèces hôtes en
termes de composition du microbiote et de composition du biotope. Toutefois, de
nombreux progrès restent à accomplir. C’est pourquoi, notre travail de thèse vise à
mieux connaitre les facteurs de variation des communautés procaryotiques et le
fonctionnmentdes écosystèmes digestifs, notamment leurs réponses à une perturbation,
chez la vache et le lapin à l’aide des outils de biologie moléculaire.
84
Etude bibliographique – Chapitre 3
.
1
/
Les contenus digestifs sont difficilement accessibles. De ce fait, la collecte des
échantillons est souvent problématique. Le prélèvement de feces est une alternative largement
utilisée pour la collecte d’échantillons sur des animaux en milieu naturel (Frey et al., 2006).
Chez l’homme, de nombreux auteurs (Chassard et al., 2008; Walker et al., 2008 ) utilisent les
fèces pour étudier la flore de la dernière partie du côlon (côlon gauche) sans toutefois avoir
préalablement démontré que ces échantillons sont effectivement représentatifs du microbiote
colique. Par ailleurs, Marteau et al. (2001) ont montré que les communautés présentes dans le
cæcum de l’homme et ses fèces sont différentes.
L’accès direct au contenu du fermenteur peut également se faire par canulation. Cette
méthode est préférentiellement utilisée chez les animaux domestiques de grande taille (vache,
mouton, cheval ; Belge et al., 2002 ; Decuypere et al., 1977; Komarek & Leffel, 1961 ;
Taniguchi et al., 2003). L’inconvénient majeur de la canulation est que, à chaque ouverture de
la canule, du dioxygène entre dans l’écosystème et modifie son degré d’anaérobiose. Chez les
animaux de petite taille (rongeur, lagomorphe, volaille, porc), les prélèvements d’échantillon
se font principalement après sacrifice des animaux (Abecia et al., 2007; Amit-Romach et al.,
2004; Deplancke et al., 2000; Guo et al., 2008a). L’inconvénient de cette technique repose
dans l’impossibilité de mesurer la variation du microbiote dans le temps chez un même
individu. C’est pourquoi, Gidenne et Bellier (1992) ont mis au point une technique de
canulation du cæcum chez le lapin. Les auteurs ont montré la représentativité des échantillons
collectés par cette technique en comparaison de ceux obtenus après le sacrifice des animaux
pour les paramètres fermentaires. Toutefois, le délai de récupération post opératoire est de
plusieurs jours et le prélèvement entraine une entrée d’air dans le fermenteur qui est en
situation normale anaérobie. Les conséquences de la canulation et de prélèvement répétés de
contenu cæcal sur le microbiote cæcal n’ont pas été étudiées chez le lapin. De plus, la
lourdeur de la méthode limite le nombre d’animaux étudiés. De nouvelles techniques, plus
représentatives ou moins invasives, sont actuellement en cours de développement. Ainsi, le
prélèvement assisté par endoscopie a été utilisé pour échantillonner du contenu gastrique chez
le cheval (Varloud et al., 2007), et du contenu colique chez l’Homme (Marteau et al., 2001).
Dans la première partie de notre travail, nous avons comparé pour nos deux espèces
modèles (vache et lapin) les communautés microbiennes (bactéries et Archaea) du fermenteur
85
Etude bibliographique – Chapitre 3
(rumen ou cæcum), des fèces (bouses et crottes dures) et des cæcotrophes (lapin seulement).
Chez la vache, l’accès direct au fermenteur était permis par la canulation du rumen. Chez le
lapin, l’accès au contenu cæcal se faisait après sacrifice des animaux. Notre objectif était
d’étudier la représentativité de matrices alternatives (crottes dures ou cæcotrophes) qui soient
faciles d’accès et dont le prélèvement n’engendre pas de perturbations dans le fonctionnement
du fermenteur. Il s’agit d’une part de pouvoir réaliser à moindre coût, des études sur une large
population d’animaux et d’autre part de pouvoir faire un suivi dans le temps sur un même
individu.
Pendant de nombreuses années, les écosystèmes digestifs de la vache et du lapin ont
été étudiés à l’aide des méthodes de culture microbienne. Ces techniques présentent
l’inconvénient de restreindre les connaissances aux populations cultivables. Suau et al. (1999)
ont montré que les populations cultivables ne représentent que 20% à 40% de la totalité des
espèces présentes dans les écosystèmes digestifs. Cette situation justifie le développement
considérable des outils d’analyses moléculaires au cours des dernières années. Dans cette
bibliographie, nous aborderons uniquement les techniques de biologie moléculaire basées sur
l’étude de l’ADN. Les techniques basées sur la microscopie (DAPI21, immunofluorescence),
la cytométrie en flux, le SIP22 ou la culture ne seront pas abordées.
5
L’écologie microbienne s’intéresse i) à la connaissance des espèces présentes dans un
écosystème (approche neutre), et ii) à comprendre les capacités fonctionnelles de cet
écosystème (approche fonctionnelle). Les approches à la fois neutre et fonctionnelle sont de
plus en plus courantes notamment avec le développement de la métagénomique.
99"%/! . + "
La connaissance des espèces composant un microbiote consiste à mettre en évidence le
polymorphisme d’un gène entre les espèces microbiennes. Ces gènes très particuliers sont
appelés des marqueurs de diversité. Les gènes codant pour la sous unité 16S de l’ARN
ribosomal (ou gène ssu) s’est largement imposé. Il est le marqueur neutre de diversité le plus
utilisé car :
21
Technique basée sur la coloration de l’ADN des cellules par le 4',6' Di Amidino-2-Phényl Indole puis
comptage des cellules colorées sous microscope
22
Stable Isotope Probing
86
Etude bibliographique – Chapitre 3
•
il est universellement présent en plusieurs copies chez tous les procaryotes et
son homologue le 18S est universellement présent chez les eucaryotes (Case et
al., 2007).
•
Il présente des zones fortement conservées au sein de chaque règne
•
il présente suffisamment de variabilité pour distinguer les espèces entre elles
(Case et al., 2007).
•
Il est neutre c'est-à-dire qu’il a évolué de façon constante avec le temps en
l’absence de pression de sélection (concept d’horloge moléculaire). De ce fait,
il permet non seulement de classer les micro-organismes mais aussi de
comprendre leurs évolutions (Zuckerkandl & Pauling, 1965).
Cependant, ce gène présente quelques inconvénients comme l’hétérogénéité de
séquences de ces copies chez certaines espèces (Klappenbach et al., 2001; Shimizu et al.,
2001) et le manque de variabilité pour distinguer les espèces proches (Normand et al., 1996;
Qi et al., 2001). Pour ces deux raisons, d’autres gènes ont parfois été utilisés comme
marqueur de diversité. Par exemple, le gène rpoB, codant pour la sous unité β de l’ARN
polymérase est présent en une seule copie par génome et discrimine mieux les espèces que les
gènes codant pour l’ARN16S (Case et al., 2007; Dahllof et al., 2000; Qi et al., 2001).
Toutefois, utiliser un marqueur de diversité autre que les gènes codants pour l’ARN 16S est
problématique car les bases de données sont moins riches pour ces autres gènes, ce qui rend
l’identification des espèces par blast de séquences moins efficace (Gutell et al., 1994).
Pour distinguer des espèces bactériennes très proches ou différentes souches issues de
la même espèce, la région intergénique entre les gènes codant pour les ARN 16S et 23S (ITS
16/23S) est le marqueur de diversité le plus utilisé (Garca-Martnez et al., 1999; Otten & De
Ruffray, 1996; Otten et al., 1996). Cette région est plus variable en taille et en séquence que
les gènes codant pour l’ARN 16S et ce qui lui permet ainsi d’être plus discriminante.
Pour limiter les contraintes de chaque gène, de plus en plus d’études se basent sur
l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs neutres, souvent les gènes dit « de ménage » (par
exemple : gapA, groEL, gyrA, ompA et pgi ; Christensen et al., 2004; Wertz et al., 2003).
Cette approche permet de mieux caractériser et identifier les espèces microbiennes en
recoupant les informations propres à chaque marqueur.
87
Etude bibliographique – Chapitre 3
2
99"%/! ,%./ %.. 11
L’approche fonctionnelle consiste à déterminer si une fonction métabolique est
présente dans une communauté microbienne donnée. Concrètement, il s’agit de détecter voire
de quantifier dans l’échantillon un ou des gènes indispensables à la réalisation de la fonction
étudiée.
Cette approche est peu utilisée dans les écosystèmes digestifs. En effet, dans ces
écosystèmes, la plupart des grandes fonctions métaboliques (par exemple la fibrolyse ou
l’amylolyse) nécessitent de nombreux complexes enzymatiques qui sont codés par un grand
nombre de gènes et qui, de plus, diffèrent selon les espèces microbiennes. A titre d’exemple,
la cellulolyse dans le rumen nécessite l’action synergique d’endoglucanases (endo-1,4-β-Dglucane hydrolase, EC 3.2.1.4), d’exoglucanases (exo-1,4-β-D-glucane cellobiohydrolase, EC
3.2.1.91) et de β-glucosidases (β-D-glucosidase, EC 3.2.1.21). Chacune de ces enzymes sont
codées par un grand nombre de gènes (Forsberg et al., 1997).
Toutefois, cette approche a été utilisée pour étudier la méthanogenèse. En effet, cette
fonction métabolique nécessite en phase terminale une enzyme spécifique, le méthyle
coenzyme-M réductase, qui permet de réduire les groupes méthyles. Or ce complexe
enzymatique est codé par un nombre restreint de gènes, appelé mcr (Méthyle coenzyme-M
réductase), ce qui rend son étude plus aisée. Ainsi, le gène mcrA a été largement utilisé pour
détecter ou quantifier les capacités méthanogènes d’un microbiote (Denman et al., 2007;
Nettmann et al., 2008; Nunoura et al., 2008).
88
Etude bibliographique – Chapitre 3
4
99"%/! -( ')(.%- 3+
La métagénomique consiste à séquencer en totalité tous les génomes microbiens
(concept de microbiome) présents dans un échantillon (Handelsman et al., 1998 ; Singh et al.,
2008). En théorie, la métagénomique fournit alors un aperçu complet de la composition de la
communauté mais aussi de ses fonctions métaboliques potentielles (Hugenholtz & Tyson,
2008). Cependant, les études actuelles sont basées soit sur l’analyse de la communauté
microbienne (Eckburg et al., 2005; Warnecke et al., 2007) soit sur l’analyse des potentialités
métaboliques du microbiote (Beloqui et al., 2006; Feng et al., 2007; Ferrer et al., 2007;
Kurokawa et al., 2007; Palackal et al., 2007). Des approches métagénomiques ont été
réalisées chez l’homme (Eckburg et al., 2005 ; Kurokawa et al., 2007 ; Turnbaugh et al.,
2007), chez la termite (Warnecke et al., 2007), chez le lapin (Feng et al., 2007) et chez le
bovin (Beloqui et al., 2006 ; Ferrer et al., 2007; López-Cortés et al., 2007 ; Palackal et al.,
2007). Ces études ont permis de mettre en évidence chez le lapin et chez la vache de
nouveaux gènes de micro-organismes impliqués dans la cellulolyse.
!A#" *' %. -%1(/+1' " & 1
# %9+/
L’hybridation moléculaire consiste à hybrider des sondes spécifiques aux cibles
potentielles présentes dans un extrait d’ADN (ou d’ARN). Différentes techniques existent : le
dot-blot (Amann et al., 1990; Harmsen et al., 2002; Odenyo et al., 1994), le FISH
(Fluorescent in situ hybridization ; Rigottier-Gois et al., 2003; Zoetendal et al., 2002a), le
SSH (suppressive soustractive ; Galbraith et al., 2004) et les biopuces (ou microarrays).
Les biopuces permettent d’analyser rapidement plusieurs milliers de gènes en un seul
essai (Figure 16). Les puces se présentent sous la forme de support (silicium, plastique, verre,
etc.) de la taille d’une lame de microscope. Sur ces supports sont délimitées plusieurs dizaines
de milliers de spots, chaque spot comprenant plusieurs copies d’une sonde spécifique aux
gènes d’intérêts. Ces sondes sont déposées par un robot (spotted microarrays) ou bien
directement synthétisées sur la puce (oligonucleotide microarrays). La méthode utilise des
ADNc marqués par un fluorochrome (cyanine Cy3 ou Cy5), et obtenus par rétro-transcription
des ARNm. L’ADNc marqué est déposé sur la puce où des hybridations spécifiques peuvent
se réaliser avec les sondes présentes sur le support. Après lavages, les sondes avec lesquelles
s’est produite l’hybridation sont révélées par la fluorescence. L’analyse de cette fluorescence
sur chaque spot permet de déterminer la présence ou l’absence (voire l’abondance relative) du
89
Etude bibliographique – Chapitre 3
gène recherché. Ainsi pour les puces phylogénétiques, on peut rechercher, sur un seul
échantillon, plusieurs milliers de taxons avec des sondes 16S spécifiques. L’utilisation de
sondes dégénérées permet également de détecter des micro-organismes non séquencés ou non
attendus. De la même façon, les puces métaboliques (fonctionnelles) permettent d’identifier
les capacités métaboliques potentielles présentes dans un échantillon. Les biopuces n’ont pas
encore beaucoup été utilisées en écologie microbienne du tube digestif (Leser et al., 2002b)
mais sont en plein essor dans d’autres écosystèmes microbiens comme les milieux aquatiques
(Günther et al., 2006; Yergeau et al., 2007) ou le sol (Barlaan et al., 2005; Brodie et al.,
2006).
Figure 16. Principe de la biopuce.
Extraction de l’ARN (a), transcription reverse avec un marquage fluorescent (b), hybridation et lecture
(c)
2
(3+ .D')
*2#$
' !3, 24#$ )
#2$ (
La majorité des travaux de séquençage en écologie microbienne a été réalisée par
clonage et séquençage de Sanger. Le gène d’intérêt (souvent les gènes codant pour l’ARN
16S) d’une communauté microbienne est d’abord amplifié par la technique de Polymerase
Chain Reaction (PCR). Chaque amplicon est cloné dans le génome d’une cellule
d’Escherichia Coli. Les cellules sont isolées et mises individuellement en culture. Chaque
clone est alors séquencé par le protocole de Sanger qui consiste en une amplification PCR
90
Etude bibliographique – Chapitre 3
classique avec l’ajout d’une faible concentration de ddNTP23 (A, T, G et C) marqués par des
fluorochromes différents. Lorsqu’ils sont intégrés à la chaine en cours de synthèse (phase
d’élongation), les ddNTP stoppent la synthèse de l’amplicon. Les amplicons obtenus sont
alors de tailles diverses et sont séparés par électrophorèse capillaire sur un gel de
polyacrylamide avant d’être lus par un scanner couplé à un laser. La couleur de fluorescence
des différentes bandes du gel permet d’attribuer le nucléotide (A, T, G ou C) à chaque paire
de base.
L’approche clonage-séquençage est longue et coûteuse ce qui limite le nombre
d’échantillons analysés et le nombre de clones séquencés par échantillon. Le caractère
aléatoire de la sélection des clones à séquencer aboutie également à des différences de
résultats pour un même échantillon (Edwards et al., 2004; Leser et al., 2002a).
Le SARST (Serial Analysis of Ribosomal Sequence Tags) utilise une série de
réactions enzymatiques pour ligaturer24 des marqueurs de séquences ribosomales (ribosomal
sequence tags). Ces opérations sont préalables au clonage et au séquençage qui peuvent
ensuite être réalisés par le protocole de Sanger (Neufeld et al., 2004). Ces marqueurs
correspondent à des régions hypervariables du gène codant pour l’ARN 16S : V1 (Neufeld et
al., 2004) ou V6 (Kysela et al., 2005). Cette approche permet alors pour chaque séquence
d’avoir jusqu’à 19 marqueurs différents de diversité (Neufeld et al., 2004). Le SARST permet
de diminuer ainsi le cout du séquençage et de couvrir plus de diversité qu’un clonageséquençage classique (environ 99% de la diversité bactérienne ruminale d’après Yu et al.,
2006).
.
5&(* !3, 24#$
Le pyroséquençage consiste à lire le nucléotide (A, T, C ou G) dès qu’il s’incorpore à
la séquence en synthèse (Figure 17). Pour cela, contrairement à une amplification PCR
classique, chaque nucléotide est incorporé successivement. Si le nucléotide présent dans le
milieu réactionnel est celui attendu, il est incorporé dans le brin d’ADN en synthèse et libère
un PPi (pyrophosphate). Ce PPi est transformé en ATP par l’ATPsulfurylase. Une luciférase
couple cet ATP à une luciférine ce qui produit une oxyluciférine en émettant un signal
lumineux capté par le scanner du séquenceur. Les nucléotides en surplus dans le milieu
réactionnel sont alors dégradés par une apyrase. Le processus se poursuit avec l’ajout d’un
23
24
2'-3'didésoxynucléosides : ddATP, ddCTP, ddGTP et ddTTP
Les marqueurs de séquences ribosomales sont « assemblés bout à bout ».
91
Etude bibliographique – Chapitre 3
autre nucléotide (Ronaghi et al., 1996; Ronaghi et al., 1998). Toutefois, la taille des
séquences obtenues est faible (<400 pb) car à chaque ajout de nucléotide l’activité des
enzymes utilisées diminue (Ahmadian et al., 2006; Ronaghi, 2001).
A
454
B
Pyro
séquencage
C
Figure 17. Principe du pyroséquençage 454.
Les réactions PCR se réalisent sur des billes de capture présentes en excès (A). Chaque bille est
déposée dans un puit (B). Le séquenceur capte le signal lumineux issu de l’activité de la luciférase et
de la sulfurylase et le reproduit sous forme d’un pic sur le chromatogramme (C). Les nucléotides en
excès sont détruits par l’apyrase (C).
Le pyroséquençage est une technique de séquençage récente qui présente 3 avantages
majeurs par rapport au séquençage de Sanger :
•
sa rapidité. A titre d’exemple, la technologie 454 associée au séquenceur GSFLX (Life
Sciences et Roche Diagnostics) séquence environ 5 millions de bases par heure contre
5 milles pour la technologie Sanger actuelle.
•
l’absence d’une étape de culture de clone. En écologie microbienne, c’est une avancée
majeure qui permet de séquencer directement l’ADN présent dans l’échantillon et
représente un gain financier et de temps considérable.
•
son faible coût à la séquence, environ 10 fois moins chère à la base nucléique que la
technique Sanger.
92
Etude bibliographique – Chapitre 3
Le pyroséquençage offre donc de nouvelles perspectives pour analyser les microbiotes
digestifs, notamment avec des analyses métagénomiques ou en comparant plusieurs
échantillons.
4
'
3+'.
' $
La PCR quantitative est une technique automatisée permettant de quantifier
précisément et rapidement un gène d’intérêt dans de nombreux échantillons. La PCR
quantitative est une amplification PCR normale couplée à la quantification d’un signal
fluorescent. L’intensité de la fluorescence à chaque cycle est directement proportionnelle à la
quantité d’amplicons produite, elle-même directement proportionnelle à la quantité initiale
d’ADN présente dans le milieu réactionnel (Elyse, 2002). La quantification est dite absolue
lorsque la quantification est basée sur l’utilisation d’une gamme étalon du gène d’intérêt dont
on connaît les concentrations initiales. La quantification relative est basée sur le calcul du
niveau d’expression du gène cible contre un ou plusieurs gènes de référence dont on ne
connaît pas forcément la concentration.
.
%2* *$
/
(
2
Le SYBR Green est une molécule qui se fixe à l’ADN lors de la phase d’élongation de
la PCR en émettant une fluorescence (Figure 18A). Le SYBR Green est beaucoup utilisé en
PCR quantitative car il est applicable quelles que soient les amorces utilisées. Cependant, les
amorces utilisées nécessitent une mise au point poussée pour éviter la formation de dimères
de primer ou de produits non-spécifiques aboutissant à des surestimations de la quantité réelle
du gène d’intérêt. La qualité de cette mise au point est généralement vérifiée en étudiant la
courbe de fusion25.
.
%2* *$
#3 #2
Cette méthode de détection est basée sur l’hybridation d’une sonde Taqman en plus
des deux amorces lors de la PCR (Figure 18B). Cette sonde est marquée avec un
fluorochrome reporter en 5’ (fluorochrome FAM26 ou VIC généralement) et un fluorochrome
quencher en 3’ (fluorochrome TAMRA27). Par un processus physique et énergétique (système
FRET28), lorsque le quencher se trouve spatialement proche du reporter, celui-ci absorbe
25
La courbe de fusion est obtenue en traçant la dérivée première de la fluorescence en fonction de la température
et la température de fusion d’un double brin correspond à un pic sur cette courbe.
26
6-carboxyfluorescein
27
6-carboxy-tetramethyl-rhodamine
28
fluorescence resonance energy transfer
93
Etude bibliographique – Chapitre 3
l’énergie du reporter et la transforme en chaleur. A l’inverse quand le quencher est éloigné, le
quenching ne fonctionne plus et la fluorescence est visible. Au cours de la polymérisation, la
Taq polymérase dégrade la sonde située sur son chemin et libère le reporter du quencher qui
émet alors la fluorescence. Les sondes TaqMan MGB29 sont particulères puisqu’une molécule
MGB est ajoutée à l’extrémité 3’ de la sonde. Cette molécule MGB joue le rôle du quencher
non fluorescent. Elle permet de stabiliser les 5 à 6 dernières bases de la sonde à son extrémité
3’ et augmente sa température d’hybridation. Ce système permet ainsi de dessiner des sondes
de plus petite taille (13 à 20 mer pour une sonde TaqMan MGB contre 18 à 30 mer pour une
sonde TaqMan classique).
Le système TaqMan est plus spécifique que le SYBR Green, mais est plus difficile à
mettre au point. En effet, la séquence d’ADN d’intérêt doit comporter entre les deux amorces
une zone conservée pour pouvoir hybrider la sonde. La température d’hybridation de la sonde
doit aussi être de 10°C supérieure à celle des amorces. Les sondes TaqMan MGB sont plus
courtes et plus spécifiques que les sondes TaqMan classiques (Kutyavin et al., 2000).
29
Minor Groove Binder
94
Etude bibliographique – Chapitre 3
A
1
2
3
: Fluorochrome stimulé
: Amplicon
: Fluorochrome libre,
non stimulé
: Amorce
Technologie SYBR Green
B
1
2
3
: Sonde Taqman
: Amplicon
: Sonde hydrolysée avec suppresseur
: Amorce
: Sonde hydrolysée avec fluorochrome stimulé
Technologie Taqman
Figure 18. Principe de la qPCR en technologie SYBR Green (A) et Taqman (B).
Pour la technologie SYBR Green, le SYBR Green associé à des fluorochromes est ajouté dans le
milieu (A1), puis durant la phase de polymérisation, les molécules de SYBR Green s’intercalent au
double brin d’ADN en émettant une fluorescence (A2, A3). L’accroissement de cette fluorescence
peut être suivi en temps réel. Pour la technologie Taqman, les sondes associées aux 2 fluorochromes
sont ajoutées sous forme libre dans le milieu (B1). Lors de l’hybridation, la proximité des
fluorochromes permet l’inhibition de la fluorescence (B2). Lors de la polymérisation, la polymérase
hydrolyse la sonde et sépare ainsi le fluorochrome émetteur du suppresseur, lui permettant d’émettre la
fluorescence (B3).
8
-9" .
-%1(/+1' "
Contrairement aux autres techniques (séquençage, biopuce), les empreintes
moléculaires permettent d’avoir rapidement une image représentative de l’ensemble de la
communauté. Elles sont également moins chères et sont donc très utilisées pour comparer la
communauté microbienne lorsque le nombre d’échantillons à analyser est élevé.
95
Etude bibliographique – Chapitre 3
Ces méthodes se basent sur la mise en évidence de la variabilité de longueur et/ou de
composition des amplicons d’un marqueur de diversité (souvent le gène codant pour l’ARN
16S). On peut distinguer différentes méthodes d’empreintes moléculaires (Tableau 12):
•
T-RFLP, AFLP : traitement des amplicons par des enzymes de restriction engendrant
des fragments de taille différente séparés par électrophorèse ;
•
ARISA : utilisation d’un marqueur de diversité de longueur variable : l’ITS 16S/23S ;
•
DGGE, TGGE, TTGE : dénaturations différentielles du double brin d’ADN des
amplicons selon leur composition en GC face à un agent dénaturant (température,
urée).
•
CE-SSCP : conformation tridimensionnelle différentielle des simples brins des
amplicons.
La migration électrophorétique des empreintes moléculaires est soit réalisée sur des
gels classiques (DGGE, TGGE, TTGE, AFLP), soit réalisée dans des capillaires gérés par un
séquenceur (T-RFLP, CE-SSCP, ARISA). Les techniques en gel traditionnelles comme la
DGGE et la TGGE sont capables de détecter les espèces bactériennes qui constituent plus de
1% de la communauté totale (Casamayor et al., 2000; Muyzer et al., 1993; Zoetendal et al.,
1998). Les techniques en capillaire (appelées CE pour Capillary Electrophoresis) sont plus
précises, plus reproductibles, moins coûteuses et plus rapides que les techniques en gel (Hong
et al., 2007; Hori et al., 2005). Contrairement aux techniques CE, les techniques en gel
traditionnelles permettent toutefois de récupérer les bandes du gel afin de les séquencer pour
faire de l’affiliation phylogénétique (Costa et al., 2006 ; Mohr & Tebbe, 2006;
Schmalenberger & Tebbe, 2003).
96
Etude bibliographique – Chapitre 3
Tableau 12. Comparaison des méthodes actuelles d'empreintes moléculaires pour étudier les
écosystèmes microbiens
Méthodes
Migration
Détection du
Identification des
Enzyme de
Etude sur le
polymorphisme des
espèces
restriction
microbiote digestif
amplicons
DGGE
gel
TGGE
composition en acide
oui par
nucléique
séquençage
non
(Kocherginskaya
et
al., 2001; Simpson et
TTGE
al., 1999; Zoetendal
et al., 1998)
T-RFLP
capillaire
CE-SSCP
capillaire
oui
(Kaplan et al., 2001;
longueur de
oui probabilité
l’amplicon
de présence dans
Leser et al., 2000;
des bases de
Nagashima
données
2003)
longueur de
non
non
l’amplicon +
(Tatsuoka
et
al.,
et
al.,
2007)
composition en acide
nucléique
AFLP
gel
ARISA
capillaire
longueur de
oui par
l’amplicon
séquençage
longueur de
non
l’amplicon
oui
non
(Scupham,
2007;
Sundset et al., 2008)
La DGGE est la technique la plus utilisée pour étudier les microbiotes digestifs. Elle a
été utilisée chez de nombreuses espèces : l’Homme (Seksik et al., 2003; Tannock et al., 2000;
Zoetendal et al., 1998), le porc (Konstantinov et al., 2002; Simpson et al., 2000), la vache
(Kocherginskaya et al., 2001; Sadet et al., 2007), le chien (Simpson et al., 2002), les rongeurs
(Deplancke et al., 2000; McCracken et al., 2001) et le poulet (Van der Wielen et al., 2002;
Zhu et al., 2002). La T-RFLP et la CE-SSCP sont des techniques plus récentes, encore peu
utilisées pour étudier les écosystèmes digestifs.
:
'
6
(2 5
Une des deux amorces utilisées en PCR est marquée par un fluorochrome ce qui
aboutit au marquage d’un seul des deux brins des amplicons (Figure 19). Les amplicons sont
ensuite dénaturés30 à 95°C puis rapidement refroidis à 0°C. Chaque brin d’ADN adopte alors
une conformation tridimensionnelle unique et répétable. Cette conformation est maintenue par
30
Séparation des doubles brins d’ADN des amplicons
97
Etude bibliographique – Chapitre 3
la formamide désionisée, utilisée comme support de mix. Cette conformation dépend : i) de la
taille (nombre d’acides nucléiques) du brin d’ADN, ii) de sa composition en bases azotées (A,
G, C ou T) et iii) de l’ordre de succession de ces bases azotées.
1
2
4
3
5
Figure 19. Principe de la CE-SSCP.
Exemple avec trois séquences d’ADN dont deux issues de la même espèce microbienne. Une région
variable d’un gène d’intérêt est amplifiée avec des amorces marquées d’un fluorochrome (1). Les
amplicons sont dénaturés à 95 °C (2). Les amplicons sont rapidement refroidis à 0°C et leur
conformation maintenue grâce à la formamide désionisée (3). Les amplicons adoptent une forme
différente car leurs longueurs et leurs compositions en acides nucléiques sont hétérogènes. Les
amplicons migrent en électrophorèse capillaire (4). Un laser détecte la fluorescence et l’information
est acquise sous forme de chromatogramme (5).
Les simples brins d’ADN en conformation tridimensionnelle sont alors déposés dans
un capillaire par électrocinétique31. Un potentiel électrique est appliqué à chaque extrémité du
capillaire, ce qui provoque la migration électrophorétique des simples brins. La forme et la
taille de la conformation de chaque brin vont donc être à l’origine d’une migration
différentielle à travers le maillage du gel : les grosses structures vont être freinées et vont
31
Une aiguille chargée positivement plonge dans l’échantillon. L’ADN chargé négativement vient se coller sur
cette aiguille. Puis l’aiguille se positionne dans l’entrée du capillaire. L’aiguille inverse sa polarité et ainsi les
brins d’ADN sont repoussés et déposés à l’entrée du capillaire.
98
Etude bibliographique – Chapitre 3
donc migrer moins loin que les petites structures. Un scanner associé à un laser va alors capter
l’intensité de fluorescence sur toute la tête de lecture et produire un chromatogramme.
Généralement, on utilise le fluorochrome 6-FAM32 (pic d'absorption à 530 nm) pour
marquer les brins d’amplicons et le fluorochrome ROX33 (pic d'absorption à 600 nm) pour
marquer l’étalon interne. L’étalon est composé de 11 à 68 brins d’ADN différents selon les
modèles (ROX, TAMRA, LYZ). Lors de la migration, ces étalons internes vont produire des
pics à intervalle réguliers qui permettront l’alignement des profils CE-SSCP entre-eux.
6
1 2"*(+#' *2 *2' 2, )#2
5(*"
La CE-SSCP est une méthode d’empreinte moléculaire robuste et reproductible (King
et al., 2005; Zinger et al., 2007) qui a été appliquée pour étudier l’écologie microbienne de
nombreux écosystèmes appartenant à des environnements variés : tube digestif (Brinkmann et
al., 2008 ; Leclerc et al., 2004), réacteur biologique (Hori et al., 2005), sol (King et al., 2005 ;
Smalla et al., 2007 ; Zinger et al., 2008), mer (Livi et al., 2006)
aire sous le pic
Bruit de fond
ligne de base
Figure 20. Exemple de profil CE-SSCP.
Dans un profil CE-SSCP (Figure 20), les pics représentent les espèces dominantes du
microbiote tandis que le bruit de fond (aire sous la courbe sans l’aire sous les pics) représente
les espèces minoritaires (Fromin et al., 2002; Nakatsu et al., 2000 ). Le bruit de fond est
associé aux co-migrations des espèces minoritaires sur les pics des espèces dominantes.
L’importance de ces phénomènes de co-migration peut être analysée sur un profil CE-SSCP.
En effet, lorsque le rapport entre l’aire sous les pics et le bruit de fond augmente, les
phénomènes de co-migration augmentent (Haegeman et al., 2008; Loisel et al., 2006). De ce
fait un profil SSCP donne i) une image représentative des espèces dominantes du microbiote
32
33
Un isomère de la carboxyfluoresceine
carboxy-X-rhodamine
99
Etude bibliographique – Chapitre 3
par l’analyse de ces pics, et ii) une idée de la quantité d’espèce minoritaire et de la richesse de
la communauté par l’analyse du bruit de fond. Cependant, comme toutes les empreintes
moléculaires, la CE-SSCP est sujette aux biais inhérent à : i) l’extraction d’ADN, ii) la PCR et
iii) un manque de résolution pour l’étude des communautés riches.
6.
#
)1 7'(# ' *2 ' )1#+5 " #' *2
La diversité bactérienne d’une communauté microbienne d’un même échantillon varie
en fonction de la méthode d’extraction utilisée (Luna et al., 2006 ; Martin-Laurent et al.,
2001; Stach et al., 2001 ; Tang et al., 2008). De plus, les produits issus de la lyse des cellules
(fragment cellulaire, agent chimique) peuvent inhiber l’activité de la Taq Polymérase
(Frostegard et al., 1999 ; Gian Marco et al., 2006). Des résultats différents sont obtenus en
fonction de la méthode d’extraction d’ADN utilisée car chaque espèce microbienne a une
sensibilité propre aux conditions d’extraction (Li et al., 2003; Scupham et al., 2007 ; Yu &
Morrison, 2004). Dans ce travail, nous avons utilisés le QIAamp® DNA Stool Mini kit
(Qiagen Ltd, West Sussex, Angleterre) pour extraire et purifier l’ADN. Scupham et al. (2007)
démontrent en utilisant du contenu cæcal de caille que ce kit d’extraction n’est pas le meilleur
en terme de quantité d’ADN extraite (environ 10 fois moins que le Invitrogen Easy-DNA kit),
en pureté de l’ADN (A260/280 varie de 2.1 à 2.2) et en nombre d’espèces lysées (le meilleur
est le Invitrogen Easy-DNA kit). Cependant, en couplant l’utilisation du QIAamp® DNA
Stool Mini kit avec une lyse mécanique (Beadbeater), Yu and Morrisson (2004) démontrent
une augmentation de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait et la diversité obtenue après
PCR. De plus, Li et al. (2003) démontrent que ce kit lyse 93% des cellules de différents
échantillons digestifs et qu’il est aussi particulièrement adapté pour l’extraction et la
purification de l’ADN des échantillons digestifs.
La technique CE-SSCP présente aussi des biais inhérents à l’étape de PCR: choix des
amorces, choix de l’enzyme utilisée et amplification différentielle. Le choix des amorces PCR
est crucial car elles sont à l’origine de la sélection des espèces qui seront amplifiées (Zhu et
al., 2002). Il est nécessaire que les amorces soient spécifiques (sélection d’un maximum
d’espèces au sein de la communauté ciblée et sélection d’un minimum d’espèces non-ciblées).
Le choix de l’enzyme nécessite de trouver le meilleur compromis entre sa fidélité (taux
erreur) et son rendement. En effet, une erreur d’un seul nucléotide engendre une conformation
du simple brin différent et donc une migration différente avec la technique CE-SSCP
(Hayashi, 1991). En revanche, une enzyme haute fidélité a un rendement moins élevé et par
conséquent engendre un nombre supérieur de cycles PCR pour obtenir une même quantité
100
Etude bibliographique – Chapitre 3
d’amplicons. Or, l’amplification de l’extrait d’ADN original se réalise au cours des 5 ou 6
premiers cycles PCR. Les cycles suivants ne font que ré-amplifier les amplicons déjà obtenus
(Kurata et al., 2001). De ce fait, les séquences présentes en grand nombre et/ou pour
lesquelles les amorces ont une forte complémentarité sont amplifiées préférentiellement
(Dahllöf, 2002) et ce d’autant plus que le nombre de cycle est important (Suzuki &
Giovannoni, 1996). En revanche ce biais semble être d’autant moins important que la
communauté étudiée est diverse (Suzuki & Giovannoni, 1996). Ainsi, l’étude des
communautés bactériennes des feces humain en DGGE ne montre pas de différence de
résultats entre 20 et 35 cycles d’amplification PCR (Zoetendal et al., 1998).
68
#
)
* + $(#' *2
Chaque technique d’empreinte moléculaire possède une résolution maximale qui
correspond au nombre de pics ou de bandes qui peuvent être identifiés. Or, les communautés
microbiennes sélectionnées par les amorces possèdent souvent un nombre supérieur d’espèces
au nombre maximum de pics ou de bandes identifiables. Dès lors, on observe des phénomènes
de co-migration. De ce fait, un seul pic ne correspond pas forcément à un seul OTU mais à un
assemblage d’OTUs (Kowalchuk & Stephen, 2001 ; Loisel et al., 2006; Schmalenberger &
Tebbe, 2003 ; Zinger et al., 2007). Loisel et al. (2006) démontrent ainsi que, dès que le
nombre d’espèces présentes dans la communauté excède 10, des co-migrations existent. De
plus, lorsque le nombre d’espèces excède 100, tous les pics du chromatogramme
correspondent à des co-migrations (Figure 21). Les OTUs susceptibles de co-migrer ne sont
pas nécessairement proches d’un point de vue phylogénétique mais possèdent seulement une
conformation tridimensionnelle proche. Toutefois, il a été démontré que les pics représentent
généralement les espèces dominantes du microbiote (Fromin et al., 2002; Nakatsu et al.,
2000).
101
Etude bibliographique – Chapitre 3
10
20
50
100
500
1 000
5 000
50 000
500 000
Figure 21. Simulation de profils CE-SSCP avec une distribution uniforme de l’abondance des
espèces.
D’après Loisel et al. (2006). Le nombre d’espèce simulé est indiqué au dessus des profils CE-SSCP.
Dès la présence de 10 espèces, on observe quelques pics représentant des co-migrations d’espèces.
Dès la présence de 100 espèces, tous les pics représentent des co-migrations.
Pour l’ensemble des raisons évoquées ci-dessus, nous avons choisi d’utiliser au cours
de ce travail, la technique de la CE-SSCP pour la caractérisation moléculaire du microbiote
des fermenteurs digestifs de la vache et du lapin. Cette technique présente en effet les
avantages d’obtenir rapidement et pour un coût modéré une image représentative de
l’ensemble de la communauté microbienne. Cette technique a été montrée robuste et
reproductible. Toutefois, le nombre d’espèces bactériennes dans les fermenteurs étudiés étant
supérieur à 100 (estimé à 300 espèces dans les feces de bovin, Dowd et al., 2008 et à 100
espèces dans le cæcum du lapin, Monteils et al., 2008), nous aurons à tenir compte des
phénomènes de co-migration dans l’interprétation des résultats. Nous avons développé un
travail méthodologique important dans le but d’exploiter au maximum l’ensemble des
informations contenues dans les profils CE-SSCP.
En résumé, la collecte des échantillons pour l’analyse des écosystèmes digestifs est
difficile et nécessite de faire des compromis : utilisation de matrices alternatives
(problème de représentativité), abattage (problème de variabilité entre individus) ou
méthodes intrusives (induit des modifications des communautés). L’étude des
communautés se réalise sur des marqueurs de diversité qui doivent être choisis pour
discriminer au mieux les espèces microbiennes étudiées. Parmi toutes les techniques
102
Etude bibliographique – Chapitre 3
disponibles, seule la qPCR permet de quantifier de façon précise les groupes microbiens.
L’image qualitative du microbiote peut se réaliser par différentes approches de
séquençage et d’empreintes moléculaires. Contrairement au séquençage, les empreintes
moléculaires permettent d’analyser un grand nombre d’échantillons et par conséquent
de tester l’influence de facteurs sur le microbiote. Parmi les techniques d’empreintes
moléculaire, la CE-SSCP est une des techniques les plus précises et reproductibles.
Toutefois, l’analyse des profils CE-SSCP nécessite de prendre en compte les biais induits
par les phénomènes de co-migration. C’est pour l’ensemble de ces raisons que nous
avons choisi, au cours de notre travail, de combiner la CE-SSCP et la qPCR pour la
caractérisation des communautés procaryotiques du rumen de la vache et du cæcum du
lapin. Au cours de nos essais, nous avons comparé différentes
méthodes
d’échantillonnage (abattage, prélèvement chirurgical, matrice alternative) dans le but
d’obtenir le meilleur compromis entre facilité, fiabilité, coût et éthique animale. Nous
avons également cherché par des outils informatiques et statistiques (algoritmes) à
extraire le maximum d’information écologique contenue dans les données fournies par
la CE-SSCP mais également à bien cerner les limites, d’un point de vue écologique, de
cette méthode.
103
104
105
106
Objectifs
Le tractus digestif des animaux comporte des compartiments spécifiques appelés
fermenteurs digestifs qui sont des écosystèmes très complexes. Chez les mammifères
herbivores actuels, on rencontre trois types de fermenteurs représentant trois stratégies
différentes pour le même service rendu (digestion des fibres alimentaires) : les fermenteurs
stomacaux, les fermenteurs coliques et les fermenteurs cæcaux. Ces trois types de fermenteurs
présentent des différences importantes en termes de volume, de type de mutualisme
hôte/microbiote, de composition des intrants, de composition des communautés microbiennes,
et de paramètres environnementaux. La caractérisation des communautés microbiennes et la
compréhension du fonctionnement de ces écosystèmes digestifs présentent un intérêt cognitif
et agronomique. C’est pourquoi, l’objectif de ce travail était de comparer les caractéristiques
éco-systémiques et les facteurs de variations des fermenteurs stomacaux et des fermenteurs
cæcaux en utilisant deux modèles animaux d’intérêt zootechnique : la vache (rumen) et le
lapin (cæcum). Pour ces deux modèles, notre étude bibliographique montre que les principaux
paramètres du milieu (pH, matière sèche etc.) de ces fermenteurs digestifs sont bien décrits.
Elle montre également, que la majeure partie des résultats concernant le microbiote
proviennent d’études utilisant la culture microbienne. Pourtant, les nouveaux outils de
biologie moléculaire offrent la perspective d’avoir une vision plus globale de ces microbiotes
et de leurs facteurs de variation. Notre étude bibliographique montre, notamment, que la CESSCP semble très adaptée aux écosystèmes riches et complexes tels que les écosystèmes
digestifs.
Nous nous sommes intéressés à caractériser i) la variabilité taxonomique (entre
espèces animales, entre individus), spatiale (inter- et intra- fermenteurs digestifs) et
temporelle des communautés procaryotiques en termes de composition, de structure et de
diversité, ii) à établir le lien entre ces communautés et leurs environnements et iii) à étudier
les conséquences d’une perturbation nutritionnelle sur ces écosystèmes (Tableau 13). De plus,
pour réaliser ces études, nous avions également pour objectif de i) mettre au point la
méthodologie CE-SSCP pour nos échantillons ainsi que des procédés de traitement et
d’analyses statistiques des profils obtenus, ii) proposer un index de biodiversité adapté à
l’étude des écosystèmes digestifs par CE-SSCP et iii) développer des systèmes de détection
qPCR spécifiques des divisions bactériennes majeures présentes dans les fermenteurs
digestifs.
107
Objectifs
Tableau 13. Récapitulatif des différents travaux et expérimentations réalisés.
Travaux
Publications /
travaux
Publication 1
StatFingerprints
Animaux
-
Facteurs ou paramètres
étudiés
Profils CE-SSCP
-
Indice de Simpson
Expérimentation 1
Simulation sur
la diversité
Publication 2
Vaches laitières
taries, n=5
Expérimentation 2
Publication 3
Lapin pré-pubère,
n=14
Publication 4
Vaches laitières
taries, n=5 (expé.
1)
Lapin pré-pubère,
n=14 (expé. 2)
Vaches laitières
taries, n=4
Temps (prandial,
hebdomadaire)
Individu
Matrice de prélèvement
Temps (hebdomadaire)
Individu
Matrice de prélèvement
Perturbation chirurgicale
Temps (hebdomadaire)
Matrice de prélèvement
Développement
informatique
Méthodologie
Expérimentation 3
Publication 5
Expérimentation 4
Publication 6
Lapin pré-pubère,
n=120
CPG : chromatographie en phase gazeuse.
108
Temps (journalier)
Fraction de prélèvement
Perturbation nutritionnelle
Temps (journalier)
Perturbation nutritionnelle
Mesures
Techniques utilisées
Traitement des profils CE-SSCP
Estimation de la diversité
Analyse de la diversité et de la structure
Affichage graphique
Comportement
Limites
Bactéries (indice de Simpson, structure)
pH, Eh
AGV, NH3-N
programmation bioinformatique
et biostatistique
CE-SSCP
Mesure ex-vivo
CPG, colorimétrie
Bactéries (indice de Simpson, structure)
pH, Eh
AGV, NH3-N
CE-SSCP
Mesure in-vivo pré-mortem
CPG, colorimétrie
Archaea (richesse, structure)
CE-SSCP
Bactéries (richesse, structure, densité)
Firmicutes (densité)
Bacteroides Prevotella (densité)
pH, Eh,
AGV, NH3-N
Bactérie (richesse, structure, densité)
Firmicutes (densité)
Bacteroides Prevotella (densité)
pH, Eh
AGV, NH3-N, matière sèche, fibres
CE-SSCP, qPCR TaqMan MGB
qPCR SYBR green
qPCR TaqMan
Mesure ex-vivo
CPG, colorimétrie
CE-SSCP, qPCR TaqMan MGB
qPCR SYBR green
qPCR TaqMan
Mesure in-vivo pré-mortem
CPG, colorimétrie, gravimétrie
Simulation informatique
5
109
110
Etude expérimentale – Chapitre 1
9
0
Dans ce travail de thèse, nous avons réalisé une analyse qualitative des communautés
procaryotiques en termes de diversité et de structure à partir de profils microbiens générés par
CE-SSCP après amplification de la région V3 des gènes codant pour l’ARN 16S. Les données
brutes de ces profils CE-SSCP nécessitent un certain nombre d’étapes de traitement des
données pour rendre comparables les profils entre eux. Après traitement, la structure de la
communauté microbienne peut être analysée à l’aide de méthodes statistiques multivariées.
En revanche, la diversité doit d’abord être estimée avant d’être analysée avec des méthodes
statistiques univariées.
L’objectif de cette partie à connotation méthodologique a été i) de développer des
algorithmes de traitement des profils plus efficaces que ceux existants, ii) de choisir des
approches multivariées qui permettent de réveler l’information écologique contenue dans nos
données, iii) de choisir la méthode la plus adaptée possible pour estimer la diversité des
communautés étudiées à partir des profils CE-SSCP, iv) de comprendre et d’interpréter cette
diversité, v) et enfin de rendre accessibles ces méthodes d’analyse à la communauté
scientifique par la création d’un logiciel libre de droits et facile d’accès pour les utilisateurs.
111
Etude expérimentale – Chapitre 1
112
Etude expérimentale – Chapitre 1
/
Les profils CE-SSCP bruts nécessitent d’être traités avant de les analyser
statistiquement. Quatre étapes de traitement des profils sont nécessaires et une étape est
optionnelle (Figure 22):
•
Etape 1 : alignement en abscisse des profils CE-SSCP entre eux grâce à l’alignement
de leurs étalons internes. En CE-SSCP, la mobilité des fragments peut varier d’une
migration (run) à l’autre en raison des changements possibles dans le microenvironnent du capillaire. Ces changements peuvent être dus à de très faibles
modifications de la lumière ou de la température (Mitchelson & Cheng, 2001). Ainsi,
ces décalages de profils CE-SSCP entre runs nécessitent d’être corrigés. Cette
calibration se réalise grâce à l’utilisation systématique d’un étalon interne dans chaque
échantillon. Cet étalon est couplé à un fluorochrome différent de celui utilisé pour
détecter la communauté étudiée. L’alignement des profils CE-SSCP consiste à aligner
les pics de l’étalon interne de chaque échantillon entre eux puis à appliquer les
modifications nécessaires pour l’alignement de chaque étalon au profil CE-SSCP de
l’échantillon.
•
Etape 2 : réorientation de la ligne de base des profils CE-SSCP de telle sorte qu’elle
soit parallèle à l’axe des abscisses. En effet, les profils CE-SSCP bruts ne sont parfois
pas parallèles à l’axe des abscisses.
•
Etape 3 : alignement des lignes de base des profils CE-SSCP. En effet, les lignes de
base des profils ne sont pas toujours au même point d’intersection sur l’axe des
ordonnées.
•
Etape 4 : normalisation des profils à une aire totale sous la courbe égale à 1. En effet,
les profils CE-SSCP bruts peuvent avoir une intensité de signal très variable.
•
Etape 5 : il est parfois nécessaire de détecter les pics et leur abondance relative au sein
des profils CE-SSCP pour l’estimation d’un indice de diversité, la transformation en
profils binaires ou encore l’utilisation de certains indices de proximité (Bray-Curtis,
Dyce-Sørensen etc.).
113
Etude expérimentale – Chapitre 1
•
Figure 22. Traitement des profils CE-SSCP.
Etape 1, Les profils CE-SSCP sont alignés en abscisse les uns par rapport aux autres, en alignant leurs étalons internes sur un étalon standard et en
appliquant ces mêmes homothéties aux profils (1). Etape 2, les profils CE-SSCP subissent une rotation pour que leur ligne de base soit parallèle à l’axe
des abscisses (2A), puis une translation en ordonnée pour que les lignes de base des profils soient confondues (2B). Etape 3, les profils sont normalisés
entre eux de telle sorte que l’aire sous les profils soit égale à 1. Etape 4, pour estimer la diversité, pour transformer les profils en profils binaires ou pour
utiliser certains indices de proximité (Bray-Curtis etc.), les pics et leur aire relative peuvent être calculés (4A et 4B).
114
Etude expérimentale – Chapitre 1
Classiquement, les signaux issus des empreintes moléculaires sont traités selon deux
approches complémentaires (Figure 23):
•
Estimation d’un indice de diversité sur chaque profil CE SSCP puis analyse statistique
univariée classique.
•
Analyse de la structure des communautés avec l’utilisation d’approche statistique
multivariée.
Profils CE-SSCP traités
Estimation de la
diversité
la diversité
la structure
Le facteur a-t-il un
effet?
ANOVA
Global ANOSIM
ou
50-50 MANOVA
Quels niveaux du
facteur diffèrent les
uns des autres ?
TukeyHSD
Pairwise ANOSIM
Quelles zones du
profil diffèrent
entre deux
niveaux ?
×
Test itératifs
ou SIMPER
Visualisation
par
ordination ou
hierarchical
clustering
Figure 23. Analyse statistique de la structure et de la diversité d’une communauté à partir de
profils d’empreintes moléculaires.
Abbréviations : ANOVA, analysis of variance ; TukeyHSD, Tukey Honestly Significant Differences ;
ANOSIM, ANalysis Of SIMilarity ; MANOVA, multivariate analysis of variance.
115
Etude expérimentale – Chapitre 1
(, . %.
1-
*
.* /
* *$ "
(
La diversité calculée à partir d’une empreinte moléculaire correspond à une estimation
d’une diversité spécifique34 α35 monocritère : souvent une région variable des gènes codant
pour l’ARN 16S.
Ces indices utilisent deux paramètres : la richesse et l’abondance relative de chaque
espèce. Cependant, les empreintes moléculaires ne permettent pas de connaître la richesse
réelle de l’échantillon car les espèces les plus rares sont masquées par les espèces dominantes
en raison des phénomènes de co-migration (Forney et al., 2004; Pedros-Alio, 2006).
Cependant, ce manque d’information sur les espèces rares pourrait être compensé en estimant
la distribution de l’abondance relative des espèces36. Or, on ne connaît pas réellement cette
distribution et par conséquent les indices de diversité classiquemet utilisés sont nonparamétriques. C’est la raison pour laquelle, plusieurs auteurs considèrent que créer un
indicateur de diversité précis et adapté aux empreintes moléculaires reste problématique
(Curtis et al., 2002; Dunbar et al., 2002; Gans et al., 2005; Hong et al., 2006; Loisel et al.,
2006; Schloss & Handelsman, 2006; Torsvik et al., 1998; Venter et al., 2004). Toutefois,
deux indices sont actuellement majoritairement utilisés : l’indice de Shannon et l’indice de
Simpson.
%-9'"' %. *
.* /
*
!'..%.
*
-9 %.
De nombreuses méthodes ont été mises au point pour estimer la diversité d’une
communauté (Hugues et al., 2001). Dans ce travail, nous comparerons les deux indices nonparamétriques les plus utilisés pour estimer la diversité à partir d’empreintes moléculaires :
l’indice de Shannon (H) et de Simpson (D).
Ces deux indices sont fondés sur des probabilités de MRR37 couplées à une attribution
de la valeur de l’information. Pour chaque individu i, (ou pic dans le cas d’un profil) on
34
Relative à l’espèce, en opposition à la diversité fonctionnelle.
La diversité α correspond au nombre d’espèces et à leur abondance dans un habitat uniforme en opposition à la
diversité β et γ.
36
Le nombre d’espèces recensées augmente avec l’effort d’échantillonnage mais plus l’échantillonnage
augmente et plus le nombre d’espèces tend à se stabiliser. De ce fait, il est possible d’estimer le nombre
maximum d’espèces dans l’échantillon soit en déterminant l’asymptote de la courbe soit en réalisant un
ajustement de courbe aux données par des régressions non-linéaires.
37
Mark-release-recapture. On compare les espèces observées plus d’une fois (recaptured) par rapport à celles
observées une seule fois (singletons).
35
116
Etude expérimentale – Chapitre 1
calcule une valeur qui est le produit de la probabilité de tirer au hasard ce pic i et de la valeur
d’information attribuée à ce pic. Ensuite, on somme la valeur attribuée à chaque pic i du
profil.
probabilité
valeur de l’information
D = ∑ (a i × ai )
H = −∑ (ai × log(ai ))
avec ai =
ni
∑ ni
L’indice de Simpson et de Shannon diffèrent sur la valeur de l’information attribuée
aux pics i. Pour l’indice de Simpson, la valeur de l’information des petits pics a le même
poids que celle des grands pics. En revanche, l’utilisation de log dans la valeur de
l’information pour l’indice de Shannon tend à minimiser l’importance des espèces abondantes
par rapport aux espèces minoritaires : cet indice donne plus de poids aux espèces minoritaires.
Or, comme évoqué en partie bibliographique, les techniques d’empreinte moléculaire
montrent davantage les espèces majoritaires du microbiote que celles minoritaires. De ce fait,
l’indice de Simpson semble plus adapté à l’étude des empreintes moléculaires que celui de
Shannon.
De plus, des approches par simulation in silico démontrent que, contrairement à
l’indice de Shannon, l’indice de Simpson est indépendant de la distribution de l’abondance
relative des espèces et de la richesse réelle de l’échantillon (Haegeman et al., 2008 ; Figure
24). Or comme évoqué précédemment, on ne connaît ni la richesse réelle ni la distribution des
échantillons à partir des profils d’empreintes moléculaires. De ce fait, l’indice de Simpson est
plus adapté à l’estimation de la diversité de communautés étudiées par empreinte moléculaire
(Haegeman et al., 2008).
C’est l’ensemble de ces éléments qui nous ont déterminés à retenir dans nos études,
l’indice de Simpson pour l’estimation de la diversité des communautés à partir des profils CESSCP.
117
Etude expérimentale – Chapitre 1
Diversité de Simpson
8
6
4
2
Nombre d’espèce réel
Nombre d’espèce réel
Nombre d’espèce réel
lognormal
geometric
Power-law
Distribution de l’abondance des espèces
Figure 24. Calcul de l’indice de Simpson par simulation de profils CE-SSCP selon des richesses
et des distributions de l’abondance des espèces variables.
D’après Haegeman et al. (2008).On s’aperçoit que l’indice de Simpson calculé est constant quelles
que soient la richesse réelle et la distribution paramétrées dans la simulation.
"
. /%-9
*+ #"+ * ,%.* *
9"%, 1
Comme évoqué ci-dessus, le bruit de fond des profils correspond aux co-migrations
des espèces minoritaires (Fromin et al., 2002; Nakatsu et al., 2000). Haegeman et al. (2008)
démontrent en utilisant des méthodes de simulation que le bruit de fond doit être pris en
compte dans le calcul de l’indice de diversité pour que l’estimation soit correcte et la plus
proche possible de la valeur de diversité réelle (Figure 25). Pour cela, les diversités réelles
( D̂ ) d’échantillons sont calculées et comparées à celles calculées à partir des profils simulés
pour les mêmes échantillons ( D̂ 0 , D̂1 , D̂ 2 ). La diversité D̂ 0 , calculée sans prendre en
compte le bruit de fond, diffère de la diversité réelle
118
D̂ dès que celle-ci est supérieure à 3. En
Etude expérimentale – Chapitre 1
revanche, la prise en compte du bruit de fond ( D̂ 1 , D̂ 2 ) permet une estimation précise de la
diversité réelle
D̂ quelle que soit la diversité de l’échantillon. En effet, D̂1 considére que le
bruit de fond correspond à un nombre infini d’espèces avec une abondance presque nulle
tandis que
D̂ 2 considère que le bruit de fond correspond à un nombre minimal d’espèces dont
l’abondance est juste inférieure à celle du plus petit pic.
En conséquence, dans nos études nous avons estimé la diversité des communautés en
tenant compte du bruit de fond des empreintes obtenues.
Figure 25. Comparaison de la diversité de Simpson réelle et de celle estimée à partir de profils
CE-SSCP simulés en fonction de la prise en compte ou non du bruit de fond.
D’après Haegeman et al. (2008). Diversité de Simpson réelle ( D̂ ),diversité de Simpson calculée (D)
en prenant en compte ( D̂1 , D̂ 2 ) ou non ( D̂ 0 ) le bruit de fond.
). , /' %. * 1 .* / *
-9 %.
Afin de mieux comprendre, la signification de l’indice de Simpson, connaître ses
limites inférieures et supérieures et comprendre l’influence de la richesse et de l’abondance
119
Etude expérimentale – Chapitre 1
relative des pics sur les valeurs de cet indice, nous avons simulé les réponses obtenues en
faisant varier différents paramètres du profil CE-SSCP. Nos simulations ont été réalisées sous
R (R development Core Team, 2009) en utilisant la fonction de calcul de diversité du
programme StatFingerprints (Michelland et al., 2009b). Pour cela, l’indice de diversité a été
calculé à l’aide de la formule suivante :
n
D = − log ∑ (a i × a i ) avec ai : l’aire relative du ième pic au sein des n pics détectés
i =1
n
∑ (a
tel que
i =1
i
+ b i ) = 1 avec bi, le bruit de fond sous le ième pic.
Nos données montrent qu’un pic est en moyenne composé de 40 scans et qu’un profil
CE-SSCP s’étend en moyenne sur 2000 scans. En théorie, dans nos conditions, la CE-SSCP
peut détecter au maximum 50 pics. Au-delà de ce seuil on observe forcement des comigrations et en conséquence un bruit de fond (b) qui augmente. Les simulations ci-dessous
correspondront donc au seuil théorique de 50 pics au-delà duquel le bruit de fond apparait.
+' )
1 2)
)
+5 *2
Diversité minimale
La diversité minimale de l’indice est égale à zéro (Figure 26). Cette diversité
correspond à un profil CE-SSCP contenant un unique pic (n=1) donc sans bruit de fond
n
(
∑ (b ) = 0) et une aire sous le pic égale à 1 (a =1).
i =1
120
i
1
Etude expérimentale – Chapitre 1
12
Indice de
diversité de
Simpson
+∞
10
8
6
4
2
Profil non-saturé
Saturation du profil
0
Nombre de pics (n) 0
Bruit de fond (Σbi) 0%
10
0%
20
0%
30
0%
40
0%
50
0%
50
20%
50
40%
50
60%
50
80%
→0
→100%
Richesse
Figure 26. Simulation de l’indice de diversité de Simpson en fonction de la richesse pour une
abondance relative constante.
Diversité maximale
La diversité maximale tend vers l’infini (Figure 26). Cette diversité serait obtenue
avec un profil complètement saturé. Le profil comporterait i) 50 pics (n=50) avec une aire
relative tendant vers 0 (lim ai → 0), ii) une proportion de bruit de fond qui tend vers 1 (lim
n
∑ (b ) → 1).
i =1
i
121
Etude expérimentale – Chapitre 1
Diversité théorique maximale pour un profil non saturé
Cette valeur correspond à la résolution maximale de la CE-SSCP dans nos conditions.
La diversité théorique maximale est de 3.9 (Figure 26). Cette diversité théorique maximale
n
correspondrait i) à un profil comportant 50 pics (n=50), ii) avec un bruit de fond nul (
∑ (b )
i =1
i
= 0) et iii) et une aire relative sous les pics constante et égale à 1/n (Ti =1/50). Ce calcul
indique que dans ces conditions (n=50 pics), une valeur de diversité supérieure à 3.9 est
synonyme de co-migrations (saturation du profil). Toutefois, en deçà de ce seuil (3.9), le
profil peut déjà commencer à saturer notamment si certains fragments d’ADN différents
migrent au même endroit sans pour autant que le profil n’atteigne 50 pics.
2" , 2
)
#( %
')
1#:*2)#2
,( 1 2)
)
+5 *2
n
Sur un profil sans bruit de fond (
∑ (b )
i =1
i
= 0), le nombre d’espèce correspond en
théorie au nombre de pic (n). Mais dès que le nombre de pic atteint la limite de résolution de
la technique (n=50 pics dans nos conditions), les espèces co-migrent et on observe
l’apparition d’un bruit de fond (b). Comme le nombre d’espèce dans les écosystèmes
complexes se chiffre à plusieurs centaines, pour étudier la richesse de nos communautés
d’étude, il est nécéssaire de tenir compte à la fois du nombre de pics (n) et du bruit de fond
n
total (
∑ (b ) ).
i =1
i
Richesse : influence du nombre de pics
Pour étudier l’influence du nombre de pics du profil CE-SSCP sur la valeur de la
diversité obtenue, notre simulation a consisté à faire varier le nombre de pics n (qui
correspond aux espèces dominantes, Loisel et al., 2006) tout en gardant l’aire relative sous les
n
pics constante (ai=constante) et leur somme égale à 1 (
∑ (a ) = 1) avec un bruit de fond nul
i =1
i
n
(
∑ (b ) =0). Les résultats sont reportés dans la Figure 26 et indiquent que plus le nombre de
i =1
i
pics augmente plus la diversité augmente.
122
Etude expérimentale – Chapitre 1
Richesse : influence du bruit de fond
Dans cette nouvelle simulation, nous avons fixé le nombre de pic à 50 et laissé
constante l’aire relative sous les pics (ai=constante) aisni que le bruit de fond relatif aux n pics
(bi=constante) pour supprimer l’influence de l’abondance relative sur la valeur de la diversité.
n
Nous avons fait varier la somme des bruits de fond des pics (
∑ (b ) = variable). Nos
i =1
n
résultats montrent que si ∑ (b i ) augmente alors
i =1
i
n
∑ (a )
i =1
i
diminue et inversement. Ces
analyses démontrent que plus la proportion de bruit de fond augmente, plus l’indice de
diversité augmente et inversement (Figure 26).
Influence de l’abondance relative : aire des pics
n
Dans ce cas, nous avons fait deux types de simulation de profil : avec (
∑ (b ) ≠0) et
i =1
i
n
sans (
∑ (b ) =0)
i =1
i
bruit de fond. Le nombre de pics est resté constant (n=constante). Nous
avons fait varier la régularité de l’aire sous les pics ai d’un modèle avec des aires sous les pics
très irrégulières vers un modèle avec des aires sous les pics constantes. Nous montrons que
pour un même nombre d’espèces, avec ou sans bruit de fond, plus les aires relatives sous les
pics respectifs sont proches (ai tend vers une constante), plus la diversité est élevée.
Inversement, plus les aires relatives sous les pics sont variables, plus la diversité est faible
(données non montrées).
En conclusion, l’indice de Simpson est l’indice le plus adapté à l’étude de la
diversité à partir del’information contenue dans les profils CE-SSCP. Cependant, la
compréhension de la variabilité de cet indice reste difficile. En effet, la varabilité de cet
indice est fonction de la richesse (nombre de pics et bruit de fond) et de l’abondance
relative des espèces.
123
Etude expérimentale – Chapitre 1
(, . %.
La composition d’une communauté se définit comme la connaissance du nombre
d’espèces, du nombre d’individus par espèce et de l’identification de ces espèces (Begon et
al., 1996). Un profil CE-SSCP ne permet pas de connaître i) le nombre d’espèce de la
communauté puisque dans des écosystèmes complexes seules les espèces majoritaires
apparaissent sous forme de pic, ii) le nombre précis d’individus par espèce car cette technique
fournit une représentation relative et par conséquent semi-quantitative, et iii) les espèces
identifiées puisque l’assignation des pics n’est pas automatique avec cette technique.
Cependant, la CE-SSCP permet d’avoir une connaissance de la structure globale de la
communauté. Ainsi, des changements concernant i) la hauteur relative des pics ou iii)
l’apparition et la disparition de pics dans une zone du profil donné peuvent être identifiés en
comparant les profils CE-SSCP. Contrairement à la diversité, l’analyse de la structure des
communautés à l’aide des données générées par la CE-SSCP n’utilise plus le profil comme
référentiel mais le pic voire le scan. Dans notre travail, l’analyse de la structure des
communautés fait donc référence à une analyse fine des modifications des pics au sein des
profils. L’analyse de cette structure a été faite par des approches statistiques multivariées.
.* / * 9"%? - (
Tous les outils statistiques pour analyser la structure se basent sur des matrices de
proximité calculées à partir d’indices de proximité. La matrice de proximité se construit en
comparant tous les profils CE-SSCP deux à deux. Une valeur est attribuée à chaque
comparaison deux à deux qui est dépendante de la méthode de calcul utilisée et donc de
l’indice de proximité choisi.
On distingue deux types d’indice de proximité, ceux de distance (plus les profils sont
différents, plus leur valeur de proximité est grande) et ceux de similarité (plus les profils sont
différents, plus leur valeur de proximité est petite). L’indice de distance le plus utilisé est la
distance euclidienne (Ghiglione et al., 2005; Sen et al., 2008), qui consiste à prendre la racine
carrée de la somme des différences d’aire au carré entre les deux profils CE-SSCP. Les
indices de similarité se déclinent en deux catégories, ceux basés sur des corrélations et ceux
basés sur une matrice sous jacente de contraintes. L’indice basé sur les corrélations le plus
124
Etude expérimentale – Chapitre 1
utilisé est l’indice de Pearson (Korthals et al., 2008; Smalla et al., 2007), qui consiste à
calculer le coefficient de détermination de Pearson entre les 2 profils CE-SSCP. Les indices
basés sur les corrélations présentent l’avantage d’être moins sensibles aux légers décalages
d’alignement des profils (artefact) que les autres indices.
De nombreux indices basés sur des matrices de contraintes existent, le plus utilisé
étant probablement celui de Bray Curtis (Bray & Curtis, 1957). Certains indices donnent
davantage d’importance aux différences fortes (Bray Curtis), tandis que d’autres mettent en
avant les différences faibles (Canberra, Bloom, 2003). Des indices dits binaires codent le
profil en présence / absence de pics (Dyce Sørensen, Dice, 1945, Sørensen, 1948) ; Jaccard
(Jaccard, 1901 ; etc.) et détectent à chaque scan dans les deux profils CE-SSCP si la valeur du
scan correspond à la ligne de base (=0) ou à un pic (=1). Ces indices calculent ensuite la
somme des valeurs issues de chaque scan en attribuant plus ou moins d’importance à la
double absence (0 et 0), à la double présence (1 et 1) ou à la présence/absence (1 et 0 ou 0 et
1).
Dans nos analyses, nous avons utilisé des matrices de distance basées sur les distances
euclidiennes à l’exception de l’analyse des communautés Archaea qui a été réalisée avec
l’indice de Dyce Sorensen. En effet, pour ces communautés, les profils CE-SSCP ont été
réalisés après une nested PCR qui peut entrainer une distorsion dans les abondances relatives.
En conséquence, nous avons étudié les profils après transformation en mode binaire
(absence/présence de pics pour chaque scan).
9"( . ' %. )"'9! 3+
Les représentations graphiques consistent à représenter la matrice de proximité dans
un plan. Deux types de représentation existent : les ordinations et les méthodes de
regroupement hiérarchique (RH). Nous présentons le principe de représentation de ces
différents méthodes sur la Figure 27, en utilisant un jeu de données volontairement simplifié à
l’extrême de 3 profils contenant 5 scans chacun.
125
Etude expérimentale – Chapitre 1
*() 2#' *2
Les ordinations consistent à représenter les profils CE-SSCP sous forme de points
dans un plan. Plus les points sont proches, plus les profils représentés par ces points sont
similaires. De nombreux algorithmes permettent d’aboutir à ce type de graphiques comme
l’ACP, l’AFC ou le nMDS (Cox & Cox, 2003). Le nMDS consiste à représenter dans un plan
le rang des valeurs de la matrice de proximité en respectant le plus possible ces valeurs de
rang. Toutefois, toutes ces techniques aboutissent à une simplification de la matrice de
proximité. Aussi, certains éléments (le stress pour le nMDS, la proportion de variance
expliquée par les composantes principales pour l’ACP) permettent d’apprécier la qualité de la
représentation.
( $(*,5 + 2' % !(#( % 3,
Le regroupement hiérarchique consiste à grouper les profils CE-SSCP les plus proches
dans la matrice de proximité sous forme de classe. Les classes de profils les plus proches
entre elles sont alors à nouveau regroupées au sein d’une classe inférieure et ainsi de suite
jusqu’à l’obtention d’une unique classe. Tous ces groupes hiérarchiques de profils sont alors
représentés sous forme d’un arbre. Différents algorithmes existent quant à la façon de réaliser
les dendogrammes (ward, single, complete, average, mcquitty, median, centroid etc. ;
Hartigan, 1975).
'
3+
#' (
+" +. !A9% !B
Les outils qui permettent de tester statistiquement des jeux de données tels que les
profils CE-SSCP (analyses multivariées) sont basés i) soit sur des permutations de Monte
Carlo (ANOSIM, MANOVA), ii) soit sur des rotations aléatoires (FF-MANOVA), iii) soit
sur des permutations aléatoires réalisées à partir d’une ordination contrainte par une ou
plusieurs variables (CCA, RDA etc.). Lorsque deux groupes diffèrent, les scans expliquant la
différence entre ces deux groupes peuvent être déterminés. Ces tests sont soit basés sur la
partition de l’indice de proximité total entre les deux groupes au sein des scans (SIMPER),
soit basés sur des tests univariées (T-test, Mann Withney, Chi carré) appliqué à chaque scan.
126
Etude expérimentale – Chapitre 1
1- Profils CE-SSCP
2- Calcul de la matrice de proximité avec les distances euclidiennes
1² + 3² + 2² + 1² + 1²
3² + 3² + 1² + 0² + 2²
DE = (16)0.5 = 4
DE = (23)0.5 = 4.8
4² + 0² + 3² + 1² + 3²
DE = (35)0.5 = 5.9
3- Représentation graphique
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
Ordination nMDS
Regroupement hiérarchique
Profil 1
Profil 3
Profil 2
-3
-2
-1
0
Profil 3
1
Profil 1
Profil 2
2
Figure 27. Exemple de méthode classique pour analyser la structure des profils CE-SSCP.
La matrice de proximité (2) est calculée à partir des profils CE-SSCP (1). Cette matrice est explorée en
utilisant une méthode d’ordination ou de regroupement hiérarchique (3).
127
Etude expérimentale – Chapitre 1
En résumé, les données brutes des profils CE-SSCP nécessitent d’être traitées en
étapes successives avant d’être analysées : alignement des abscisses et des ordonnées,
orientation des lignes de base et normalisation. L’indice de Simpson se révèle être
l’indice le plus adapté pour estimer la diversité dans les profils issus des empreintes
moléculaires. Toutefois, le calcul de cet indice sur les profils CE-SSCP nécessite d’être
adapté pour estimer au mieux la réelle diversité de Simpson, notamment en prenant en
compte l’importance du bruit de fond. Avec ces adaptations, la diversité de Simpson
varie de zéro à l’infini, elle augmente quand la richesse augmente (nombre de pic et/ou
aire du bruit de fond) et/ou l’abondance relative des pics devient constante. L’analyse de
la structure des communautés se réfère à l’analyse fine de la présence/absence des pics et
de leur abondance relative le long des profils CE-SSCP. Les indices de proximités basés
sur des distances, qui sont indépendants des critères subjectifs de détection des pics,
semblent les mieux adaptés pour l’analyse de cette structure des communautés.
128
Etude expérimentale – Chapitre 1
9
1
/
1
In press dans Molecular Ecology Resurces
R. J. Michelland, S. Dejean, S. Combes, L. Fortun-Lamothe, L. Cauquil
Mots clés : empreinte moléculaire, écologie, statistiques, diversité, traitement de profil
Titre abrégé: traiter et analyser les profils d’empreintes moléculaires
Résumé
Les empreintes moléculaires sont des méthodes largement utilisées pour étudier les
communautés microbiennes présentes dans de nombreux environnements. StatFingerprints est
un programme informatique libre de droits qui permet non seulement d’importer, de traiter et
de tracer les profils issus des empreintes moléculaires mais aussi de réaliser de nombreuses
analyses statistiques et d’estimer des indices de diversité. StatFingerprints utilise le
programme R pour réaliser les calculs statistiques et afficher les graphiques. Il est doté d’une
interface graphique intuitive et facile d’accès qui ne nécessite aucune connaissance en
programmation. Il est particulièrement adapté pour tester l’effet d’un facteur de variation sur
les communautés microbiennes et pour établir les relations entre les communautés
microbiennes et les paramètres environnementaux. Les analyses multivariées incluses dans ce
programme sont les ordinations, les classifications hiérarchiques et les tests statistiques basés
sur hypothèse comme la 50-50 MANOVA (50-50 multivariate ANOVA), l’ANOSIM
(analysis of similarity) ou le SIMPER (similarity percentage procedure). StatFingerprints
offre également des possibilités de représentations graphiques en 3 dimensions.
129
Etude expérimentale – Chapitre 1
130
Etude expérimentale – Chapitre 1
9
/
/
In press in Molecular Ecology Resurces
R. J. Michelland *,†,‡, S. Dejean §, S. Combes *, L. Fortun-Lamothe *, L. Cauquil *
*
INRA, UMR 1289 TANDEM, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
†
Université de Toulouse, INPT-ENSAT,
UMR 1289 TANDEM, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
F-31076 Toulouse, France ;
§
‡
ENVT, UMR 1289 TANDEM,
Université Paul Sabatier, Institut de Mathématiques, 31062
Toulouse cedex 9, France.
Keywords: fingerprint, ecology, statistic, diversity, processing
Correspondence : Laurent Cauquil. Address : INRA, Université de Toulouse, UMR 1289,
Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et Métabolisme, Chemin de Borde-Rouge,
Auzeville, BP 52627, F-31326 Castanet-Tolosan Cedex, France. Fax: 33 (5) 61 28 53 18. Email: laurent.cauquil@toulouse.inra.fr
Running title: processing and analysis of fingerprint profiles
131
Etude expérimentale – Chapitre 1
132
Etude expérimentale – Chapitre 1
Molecular fingerprint methods are widely used to compare microbial communities in
various habitats. The free program StatFingerprints can import, process, and display
fingerprint profiles and perform numerous statistical analyses on them, and also estimate
diversity indexes. StatFingerprints works with the free program R providing an environment
for statistical computing and graphics. No programming knowledge is required to use
StatFingerprints thanks to its friendly graphical user interface. StatFingerprints is useful to
analyze the effect of a controlled factor on the microbial community and to establish the
relationships between the microbial community and the parameters of its environment.
Multivariate analyses include ordination, clustering methods and hypothesis-driven tests like
50-50 multivariate ANOVA, analysis of similarity (ANOSIM) or similarity percentage
procedure (SIMPER) and offer the possibility of plotting ordinations as a three-dimensional
display.
133
Etude expérimentale – Chapitre 1
134
Etude expérimentale – Chapitre 1
2
Molecular fingerprint methods and especially those based on capillary electrophoresis
(CE) such as terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), single-strand
conformation polymorphism (SSCP) or automated ribosomal intergenic spacer analysis
(ARISA) offer, at little cost, a rapid high resolution snapshot of the overall community in a
sample (Hong et al., 2007; Hori et al., 2005; King et al., 2005; Zinger et al., 2007).
Consequently, they have been widely used in various environments to compare the
communities of numerous samples (Babendreier et al., 2007; Guo et al., 2007; Kent et al.,
2007; King et al., 2005; Leclerc et al., 2004; Osborn et al., 2000; Tatsuoka et al., 2007).
However, the fingerprint profiles generated are difficult to analyze. Firstly they need to be
processed before they can be compared, and secondly, the large data sets generated require
multivariate statistical methods. Dedicated programs like GeneMarker (SoftGenetics Inc),
Safum (Zemb et al., 2007), DAx (Van Mierlo program) or GeneScan (Applied Biosystems)
provide no or only rudimentary statistical tools, with limited, if any, export possibilities to
perform further analyses. They are also expensive. Furthermore, pre-programmed algorithms
cannot be parameterized sufficiently to be satisfactorily used for ecological purposes (Zemb et
al., 2007). For example, it was recently demonstrated that the area under the peaks is
informative and must be taken into account for statistical analysis; hence programs need to be
able to retain this background (Loisel et al., 2006).
Therefore, due to the wide use of fingerprint methods and the inadequacy of current
programs for processing and analyzing fingerprint profiles, we developed a free program
called StatFingerprints. No programming knowledge is required to use it, thanks to its friendly
graphical user interface (GUI). It can i) import raw files containing fingerprint profiles (FSA,
ASCII), ii) process fingerprint profiles (alignments, normalization etc.), iii) estimate diversity
indexes, iv) perform univariate and a wide range of multivariate statistical tests, and v) plot in
three dimensions with dynamic control. The program StatFingerprints works with R: a free
program providing an environment for statistical computing and graphics (R development
Core Team, 2008). StatFingerprints and its user guide can be downloaded from the
comprehensive
R
archive
network
at
http://cran.r-
project.org/web/packages/StatFingerprints/index.html. In this note, we describe some
possibilities of the program StatFingerprints.
135
Etude expérimentale – Chapitre 1
Import fingerprint profiles
1. Import data
Fingerprint
profiles in
ASCII files
Fingerprint
profiles in
FSA files
Import variables
Fingerprint profiles in
an ecological table in
ASCII files
Process fingerprint profiles
2. Profiles management
Alignment with
internal standard
Manage and plot fingerprint profiles
Change
names
Add fingerprint
profiles
Plot in 2
dimensions
Import spreadsheets of
quantitative or qualitative
variables in ASCII files
Delete fingerprint
profiles
Plot dynamically in 3
dimensions
Delete background under
peaks
Baseline
rectification and
scale range
definition
Normalisation
Correct peaks presenting
default
Transform into
presence/absence
Univariate statistic: diversity index
3. Statistical analysis
Multivariate statistic: structure
Ordination:
nMDS, PCA
Dendrogram:
hierarchical
clustering,
heatmap
Multivariate test: 50-50
MANOVA, ANOSIM,
50-50 multivariate
correlation
SIMPER,
iterative
tests
Test variability
within groups
Calculate diversity
estimators
Descriptive
statistic: Mean,
SD, Shapiro Wilks,
Bartlett
Multifactor ANOVA,
Pearson correlation,
Tukey HSD
Figure 28. Structure of the StatFingerprints program.
Three main parts guide the user: (1) importation, (2) management and (3) statistical analysis of the fingerprint profiles. Arrow indicates successive steps. A
step with double borders offers the possibility of exporting its numerical or graphical results. Steps with a dashed border are optional.
136
Etude expérimentale – Chapitre 1
4
5
Fingerprint profiles from CE can be imported into StatFingerprints using all ASCII
formats (Figure 28) and also directly from the output of ABI Prism sequencers (Applied
Biosystems) using the FSA files. Data generated by traditional gel-based methods like DGGE
(Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis) or TGGE (Temporal Temperature Gel
Electrophoresis) can also be imported as chromatograms. All results can be exported in all
ASCII formats and plots can be exported in Metafile, Postscript, PDF, png, bmp, TIFF or jpeg
formats.
8
CE raw fingerprint profiles can be aligned with a safe manual control of the detection
of the internal standard peaks. The baseline of the fingerprint profiles can also be aligned and
horizontally reoriented. The background under peaks of fingerprint profiles, which is often
considered as noise, can be deleted. The area under each fingerprint profile can be
normalized. Processing the fingerprint profiles in such a way is required to compare them for
further statistical analysis. Some authors prefer to transform fingerprint profiles into binary
fingerprint profiles due to the semi-quantitative information given by fingerprint methods
(Blackwood et al., 2003; Green et al., 2004; Ramírez-Moreno et al., 2005). The program
StatFingerprints can detect peaks in profiles and then transform areas with and without peaks
to one and zero respectively to obtain such binary profiles.
:
5
Diversity indexes are frequently estimated from fingerprint profiles. They summarize
all the scans of a fingerprint profile into a single value by taking into account the number of
peaks and their relative abundance. StatFingerprints can estimate several diversity indexes:
the richness, Simpson’s negative logarithm, one minus Simpson, Shannon, Buzas and
Gibson’s evenness and equitability (Begon et al., 1996; Magurran, 2004; Rosenzweig, 1995).
The algorithm for the detection of the peaks in the fingerprint profiles can be easily and fully
parameterized. For example, artefact peaks can be deleted using a threshold and the peaks’
abundance can be calculated using their heights or their areas. StatFingerprints can perform
some commonly used univariate tests: multifactor ANOVA, Tukey's Honest Significant
Difference, Pearson’s correlation, Bartlett’s test or Shapiro Wilks’ test. These tests can be
used to calculate basic statistics either on the diversity index or on other imported variables.
137
Etude expérimentale – Chapitre 1
Figure 29. Analysis of CE-SSCP profiles of the Archaeal community of the digestive tract of the
rabbit and the cow using StatFingerprints.
Raw CE-SSCP profiles (a) require processing before they can be compared (b). Then they can be
compared using heatmap (c) or three-dimensional nMDS (d). The black and grey colors correspond to
rabbit and cow, respectively. Heatmap was calculated using Euclidean distances and the Ward
algorithm. The nMDS was computed with 10000 random starts using Euclidean distances. The stress
of the nMDS was equal to 0.050.
E
F
The proximities between pairs of fingerprint profiles can be calculated using 13
proximity measures: Euclidean distance, maximum distance, Manhattan distance, Canberra
138
Etude expérimentale – Chapitre 1
distance, Minkowski distance, Bray Curtis similarity index, chi-squared correlation index,
Ruzicka similarity index, Roberts similarity index, Jaccard binary index, Dice-Sørensen
binary index, Ochiai binary index, Stainhaus binary index (Legendre & Legendre, 1998;
Magurran, 2004; Wolda, 1981). The proximity measures between fingerprint profiles can be
explored using either ordination or dendrogram methods (Figure 29). Ordination methods
available in the program StatFingerprints are principal components analysis (PCA) and
random starts non metric multidimensional scaling (nMDS ; Borg & Groenen, 2005; Cox &
Cox, 2003). These analyses produce a display in 2 or 3 dimensions in which each point
represents one fingerprint profile. From the proximity matrix, nMDS plots points so as to
respect as well as possible the proximity measures between each pair of profiles. On the other
hand, PCA does not use the proximity matrix. PCA calculates the linear combination with the
largest variance within scan values of all profiles to produce synthetic variables. These
synthetic variables determine the axis of the space where fingerprint profiles are plotted as
points (Hotelling, 1933). Dendrogram methods available in StatFingerprints are hierarchical
clustering and heatmap. Seven dendrogram construction algorithms are available: Ward,
nearest neighbor, unweighted pair-group average, average, Mc Quitty, median and centroid
(Gordon, 1999; Murtagh, 1985). Heatmap is a hierarchical clustering coupled with a
simplified representation of the profiles using a color data set (the signal intensity is translated
into a gradient of colors). This facilitates the visual interpretation of the plot.
The influence of a factor on the structure of the microbial community has often been
studied by a subjective observation of the clusterings on the ordination plot but has rarely
been statistically determined using a hypothesis-driven test. StatFingerprints offers two
hypothesis-driven tests : 50-50 multivariate ANOVA with rotations (Langsrud, 2002;
Langsrud, 2005) and analysis of similarity (ANOSIM) with Monte Carlo permutations
(Chapman & Underwood, 1999; Clarke, 1993). ANOSIM analysis can be based on any of the
13 proximity measures available but can test the effect of only one factor. In the other hand,
the 50-50 multivariate ANOVA is not based on proximity measures but can test the effect of
two or more factors and their interactions. The multivariate post-hoc test can be performed
using pairwise ANOSIM (Clarke, 1993) to understand which levels differ from the others
within a factor. To go further into the analysis and to understand which scans along a
fingerprint profile explain the difference between two groups of fingerprint profiles (two
levels within a factor), StatFingerprints offers either the similarity percentage procedure
(SIMPER; Clarke, 1993) or iterative tests. The SIMPER calculates the relative contribution of
139
Etude expérimentale – Chapitre 1
each scan of a fingerprint profile to the dissimilarities between the two groups, whilst the
iterative test performs a univariate test between the two groups for each scan of the profile.
The univariate test can be a T-test, Mann Withney or Fisher's exact tests for normal, nonnormal, nominal (binary fingerprint profiles) variables respectively. StatFingerprints can also
calculate the variability within each group of fingerprint profiles and test whether this
variability differs significantly between groups. Establishing the relationship between the
structure of the microbial community and environmental parameters, for example a gradient
pollution, is often required. For this, StatFingerprints provides a 50-50 multivariate
correlation (Langsrud, 2002; Langsrud, 2005).
G
In conclusion, StatFingerprints provides a useful tool for scientists in the field of
microbial ecology who use molecular fingerprint methods and especially those based on CE.
It offers, in a single free program, a way to easily manipulate fingerprint profile output data
from the sequencer, and perform numerous statistical analyses on them. A wide range of
importing and processing methods, multivariate statistical tests, and the ability to estimate
diversity indexes is available, using a user-friendly graphical interface. All the results and
figures are exportable and can be easily included in a publication. To our knowledge,
StatFingerprints is the only free program to include statistical tests like pairwise ANOSIM,
SIMPER, iterative tests or heatmap to analyze the fingerprint data.
H
I
F
We thank Olivier Zemb, Jerôme Hamelin and Laurence Lamothe for helpful ideas and
discussion. We are grateful for Mélanie Martignon and Moussa Kimsé for their suggestions.
140
Etude expérimentale – Chapitre 1
J
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143
Etude expérimentale – Chapitre 1
144
Etude expérimentale – Chapitre 2
;
0
;
/
0
Dans cette seconde partie, nous avons cherché à identifier les facteurs de variation des
fermenteurs digestifs dans les deux modèles animaux étudiés : la vache et le lapin. L’objectif
de cette partie a donc été i) d’étudier la variabilité entre espèces (vache vs lapin), entre
individus, dans l’espace (le long du tractus digestif et au sein du fermenteur principal) et dans
le temps (au cours de la journée et entre plusieurs semaines successives) des communautés
procaryotiques (bactérie, Archaea) et de leur biotope et ii) d’établir les relations
microbiote/biotope.
Notre objectif étant de réaliser une approche comparée entre la vache et le lapin, nous
nous sommes attaché à décliner nos essais dans ces deux espèces de la façon la plus proche
possible et avons ensuite traité les échantillons, exploité et analysé les données de façon
contemporaine et similaire. Néanmoins, cette volonté a été confrontée aux différences
physiologiques entre les deux espèces. Ainsi, certains choix méthodologiques valides pour
une espèce pouvaient se réveler des non sens physiologiques pour une autre. Par exemple,
chez la vache, nous avons distribué deux repas par jour, de manière contrôlée. Nous avons
ensuite pu étudier l’évolution des communautés bactériennes et des paramètres fermentaires
au cours de la période post prandiale. Cette situation n’a pas de sens chez le lapin. En effet,
cet animal réalise de très nombreux repas au cours de la journée (20 à 30 repas). De plus, le
cæcum étant situé en aval du tube digestif, le flux des nutriments entrant dans ce fermenteur
est plus régulier et plus indépendant de l’ingestion de l’hôte. Le contenu ruminal est
hétérogène et il est probable que les communautés bactériennes présentes dans la partie
ventrale du rumen sont différentes de celles vivant dans la partie dorsale du rumen ou dans le
réticulum. Nous avons donc introduit ce facteur de variation (zone de prélèvement dans le
rumen) dans nos études pour la vache. En revanche, le contenu cæcal est pâteux et homogène
et cette notion de zone de prélèvement n’a pas de sens chez le lapin. Enfin, en raison de la
taille de l’animal, le nombre d’animaux utilisé peut être plus important chez le lapin que chez
la vache, surtout pour des vaches porteuses de canule. Afin de gagner en puissance
expérimentale, nous avons choisi de profiter de cette possibilité pour travailler sur des
effectifs plus importants chez le lapin.
C’est pour l’ensemble de ces raisons, que les schémas expérimentaux ne sont pas
toujours identiques entre les deux espèces étudiées et qu’ils ont aboutis à des publications
parfois séparées (à l’exception de la publication sur les Archaea). En revanche, au sein de la
145
Etude expérimentale – Chapitre 2
discussion générale, les résultats sont discutés sous l’angle d’une approche comparée entre les
deux espèces modèles.
146
Etude expérimentale – Chapitre 2
In press dans Journal of Applied Microbiology
R.J. Michelland, V. Monteils, A. Zened, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, J. Hamelin, L.
Fortun-Lamothe
Mots clés: bactéries, rumen, fèces, CE-SSCP, paramètres environnementaux
Titre abrégé: les communautés bactériennes dans le tractus digestif des vaches
Résumé
Une amélioration de la connaissance des communautés bactériennes résidant dans le
tube digestif des herbivores est nécessaire pour améliorer leur efficacité digestive. Le but de
ce travail était d’étudier les variations spatiales et temporelles des communautés bactériennes
du tube digestif de la vache et les corrélations avec les paramètres environnementaux. Le
contenu ruminal et les fèces de 5 vaches ont été prélevés pendant 3 semaines, tandis que du
contenu du réticulum a été prélevé au cours de la 3ème semaine. Les communautés
bactériennes ont été caractérisées par l’analyse des profils CE-SSCP (Capillary
Electrophoresis Single-Stranded Conformation Polymorphism) basées sur une amplification
de la région V3 des gènes codant pour l’ARNr 16S. Nous montrons que la structure des
communautés bactériennes diffère entre le réticulo-rumen et le contenu fécal en raison de
l’abondance de quelques OTUs (operational taxonomic units) qui change d’une semaine à
l’autre. La structure de la communauté bactérienne du rumen a été corrélée aux concentrations
d’acide propionique et de NH3-N. En conclusion, les communautés bactériennes du tube
digestif des bovins varient dans l’espace et le temps. Les résultats de ce travail impliquent que
l’étude des communautés bactériennes du tube digestif des herbivores devrait être étendue au
côlon. Une meilleure connaissance de l’amplitude et de l’origine de la variation temporelle
des communautés bactériennes du rumen permettraient de mieux comprendre et en
conséquence d’améliorer le contrôle de l’activité fermentaire chez les herbivores.
147
Etude expérimentale – Chapitre 2
148
Etude expérimentale – Chapitre 2
/
R.J., Michelland1,2,3, V. Monteils1,2,3, A. Zened1,2,3, S. Combes1,2,3, L. Cauquil1,2,3, T.
Gidenne1,2,3, J. Hamelin4, L. Fortun-Lamothe1,2,3
In press in Journal of Applied Microbiology
1
INRA, UMR 1289 TANDEM, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
2
Université de Toulouse, INPT-ENSAT,
UMR 1289 TANDEM, F-31326 Castanet-Tolosan, France; 3 ENVT, UMR 1289 TANDEM, F31076 Toulouse, France;
4
INRA, UR 050, Laboratoire de Biotechnologie de
l’Environnement, F-11100 Narbonne, France.
Running title: Bacterial community in bovine digestive tract
Corresponding author. Name : L. Fortun-Lamothe. Mailing address : INRA, UMR 1289,
Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et Métabolisme, BP 32607, 31326
Castanet Tolosan Cedex, France. E-mail: lamothe@toulouse.inra.fr. Phone: 33 (5) 61 28 53
18. Fax: 33 (5) 61 28 53 19.
149
Etude expérimentale – Chapitre 2
150
Etude expérimentale – Chapitre 2
Aims: Improved knowledge of the bacterial community of the digestive tract is required to
enhance the efficiency of digestion in herbivores. This work aimed to study spatial and
temporal variations of the bacterial communities in the bovine digestive tract, and their
correlation with gut environmental parameters.
Methods and Results: Rumen content and fæces of five cows were sampled for three weeks.
In addition, reticulum content was sampled during the 3rd week. Bacterial communities were
assessed by studying Capillary Electrophoresis Single-Stranded Conformation Polymorphism
(CE-SSCP) profiles of 16S rRNA genes. The bacterial community structure differed between
the forestomach and fæcal contents. The abundance of several operational taxonomic units
(OTUs) changed from week to week. Bacterial community structure of the rumen was
correlated to propionic acid and NH3-N concentrations.
Conclusions: The bacterial community of the bovine digestive tract varied in space and time.
Significance and Impact of the Study: The study of the bacterial communities of the
digestive tract in herbivores should be widened from the rumen to the large intestine. The
amplitude and origin of the temporal variation of the ruminal bacterial community needs to be
better understood to improve the control of the fermentative activity in herbivores.
Keywords: Bacteria, rumen, fæces, CE-SSCP, environmental parameters
151
Etude expérimentale – Chapitre 2
152
Etude expérimentale – Chapitre 2
2
Bacteria are present throughout the digestive tract of ruminants. They are predominant
compared to other microbes in the forestomach, i.e. the rumen and the reticulum, and the large
intestine. They are also present in other compartments, such the small intestine and the
cæcum, but in smaller numbers (Edwards et al., 2005). These ecosystems harbor a complex
range of microbes living in an anaerobic and reductive environment. The rumen contains 101011
bacteria, 109-10 phage particles, 108-9 protozoa, 107-9 Archaea and 103-5 fungal zoospores per
milliliter (Klieve & Swain, 1993; Mackie et al., 1997). The microbial ecosystems in other
parts of the ruminant digestive tract are less well known, but Lin et al. (1997) showed that the
relative abundance of bacteria, eucarya and Archaea varied according to the digestive
compartment. Indeed, in the goat digestive tract, bacterial rRNA accounts for 59% of the total
rRNA present in the rumen, compared to 66% and 73% in the colon and cæcum respectively.
The bacterial and protozoal communities play a key role in digestion, hydrolyzing
plant cell walls and producing volatile fatty acids, ammonia and vitamins directly utilized by
the ruminant (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008d). This microbial activity releases
hydrogen which is used by the Archaea to produce methane (Janssen & Kirs, 2008). The three
main currently known cellulolytic bacterial species are the Gram-negative Fibrobacter
succinogenes and two species of Gram-positive bacteria, Ruminococcus albus and
Ruminococcus flavefaciens (Krause et al., 2003). For several decades, numerous studies have
been devoted to understanding the factors which influence the fermentative activity in the
cow’s rumen (Allen, 1997; Nagaraja & Titgemeyer, 2007; Owens et al., 1998). New
knowledge of the bacterial community itself is essential to advance the control of microbial
digestion. This knowledge has recently increased with the development of molecular tools
based on 16S rRNA gene heterogeneity (Deng et al., 2008). These techniques have revealed
the extraordinary richness of bacterial species in the rumen, revealing many new species. In
contrast, little is known about the factors that influence the bacterial richness. One generally
distinguishes biotic factors, like interactions between microbial communities and their hosts,
from abiotic factors like environmental parameters such pH or redox potential.
This study aimed to assess the spatial, temporal and inter-animal variations of bacterial
communities residing in the bovine forestomach and large intestine. We studied both structure
and diversity index of the bacterial communities and their correlation with gut environmental
parameters. We used Capillary Electrophoresis Single-Stranded Conformation Polymorphism
153
Etude expérimentale – Chapitre 2
(CE-SSCP) generated by amplification of the V3 region of the 16S rRNA gene. It is a
reproducible and high-resolution methodology which permits a rapid analysis of the whole
bacterial community (King et al., 2005; Zinger et al., 2007).
5 cows
1st week
Ventral rumen at t3
Fæces at t3
2nd week
Ventral rumen at
Fæces at t3
3rd week
t0
t3
t6
Ventral rumen at t3
Fæces at t3
Dorsal rumen at t3
Reticulum at t3
Figure 30. Scheme of the experimental design.
t0, t3, t6 stand for before meal, 3 h and 6 h after the meal respectively.
4
4
5
Five non-lactating Prim Holstein cows fistulated in the rumen were kept indoors in
individual pens. They were fed twice daily at 0800 h and 1700 h with a maintenance diet of 2
kg of hay, 2 kg of barley straw, 1 kg of ground corn and 0.08 kg of mineral supplement. They
were adapted to the diet for 21 days before sampling to stabilize the digestive tract ecosystems
at the beginning of experiment. The animals were cared for in accordance with the guidelines
for animal research of the French Ministry of Agriculture (Anonymous, 27 avril 1988).
Samples were collected once a week, on the same day, for three consecutive weeks
(Figure 30). To study the bacterial community of the large intestine, fæces were collected
immediately after their excretion. During the 1st week, ventral rumen and fæces samples were
collected 3 h after the morning meal. During the 2nd week, ventral rumen samples were
collected before the meal and 3 h and 6 h after the morning meal whereas fæces samples were
collected once, 3 h after morning meal. During the 3rd week, ventral and dorsal rumen
samples, reticulum and fæces samples were collected 3 h after the morning meal. A total of 50
samples were collected and filtered (1.6 mm) before storage at -20°C until analysis. The
samples taken to determine concentrations of NH3-N and VFA were collected each week in
the liquid phase of the ventral rumen content, 3 h after the morning meal, and stored at -20°C
in a 2 % (w/v) mercuric chloride solution.
154
Etude expérimentale – Chapitre 2
42
Concentrations of VFA were determined by Playne’s (1985) method by automated gas
separation (5890A, Hewlett Packard, Avondale, PA). NH3-N concentrations were determined
by a colorimetric method as previously described by Hach et al. (1987). Ventral ruminal pH
and redox potential were measured ex-vivo as described by Marden et al. (2005), the day
following sampling. The measurements of pH and redox potential were carried out with a
glass electrode (combined electrode DG SC, Metrohm) and a platinum electrode (Pt SC with
Ag/AgCl as reference, Metrohm). The redox potential measurements were corrected by
adding the potential of the reference hydrogen electrode: +199 mV.
44
5
Total DNA was extracted and purified with QIAamp® DNA Stool Mini kit (Qiagen
Ltd, West Sussex, England) directly from approx. 0.2 g of sample corresponding to 227 ± 173
ng µl-1. The V3 region of the 16S rRNA genes of bacterial species, corresponding to a 205 bp
fragment in Escherichia coli (position 329 to 534), were used as a diversity marker by
performing PCR using the primers W49 5'-ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3' and 6FAMlabeled W34 5’-TTACCGCGGCGTGCTGGCAC-3’ (Delbès et al., 1998; Zumstein et al.,
2000). PCR was carried out in 50 µl reaction mixtures containing 5 µl 10× buffer, 0.2 µM of
each primer, 200 µM of each dNTP, 0.25 U Pfu Ultra II Fusion HS DNA polymerase
(Stratagene), 25 µg bovine serum albumin (Biolabs) and 1 µl of 200 times diluted DNA
extract. The temperature program consisted of 2 min at 95 °C, 30 cycles with 30 s at 94 °C, 30
s at 61 °C, 30 s at 72 °C followed by a final extension at 72 °C for 3 min. PCR products were
checked for appropriate size by 1 % agarose gel electrophoresis.
48
Briefly, Capillary Electrophoresis Single-Stranded Conformation Polymorphism (CESSCP) is a capillary electrophoretic method based on heterogeneity of single-stranded
ribotype secondary structure providing different mobility through a gel. An internal standard
using a different fluorochrome 6-carboxy-X-rhodamine (ROX, Applied Biosystems-HD400)
was analyzed simultaneously. The SSCP mix contained 1 µl of PCR product, 7.8 µl of
deionized formamid (Genescan, Applied Biosystem) and 0.2 µl of the internal standard ROX.
Mix was denatured at 95 °C for 5 min and placed on ice before loading. CE-SSCP was
performed on an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer using a 36 cm length capillary and a
7.2 % non-denaturing polymer consisted of 80 % CAP polymer (Applied Biosystems), 10 %
155
Etude expérimentale – Chapitre 2
glycerol and 10 % 10x TBE Buffer (Applied Biosystems). Electrophoresis was performed at
25 °C for 3500 s at 15 KV and produced chromatograms containing both sample and internal
standard signals. Bacterial communities were spread out in about 1200 scans. Co-migration
events of PCR products belonging to different bacterial species could occur during capillary
electrophoresis, resulting in a single peak in the CE-SSCP profile (Loisel et al., 2006; Zinger
et al., 2007). Therefore, one should remember that a single peak could correspond to an
operational taxonomic unit (OTU) assemblage rather than a single OTU.
CE-SSCP data processing was computed with SAFUM software, version 4.4, running
on Matlab version 6.0 (Zemb et al., 2007). CE-SSCP profiles were aligned together using
pairwise alignment of their internal standard with the same reference internal standard. Total
areas under CE-SSCP profiles were normalized to one producing relative abundance data.
Alignment and normalization guaranteed reliable comparison between samples.
4:
5
Estimating a diversity index consists of summarizing a complex community
represented by a molecular fingerprint pattern in a single value by taking into account the
number of species (number of peaks) and their relative abundance (area under each peak).
Simpson’s diversity index gives the probability of two individuals randomly taken from an
infinitely large community belonging to the same species (Simpson, 1949). It is heavily
weighted towards the most abundant species and thus is better suited to patterns of molecular
fingerprints where only principal OTUs are plotted as peaks. It is estimated as the negative
logarithm of the Simpson index named D’ (Rosenzweig, 1995) ; Haegeman et al., personal
communication). The lowest value of D’ is obtained when the profile contains only one peak
and the highest value of D’ when the profile contains many overlapping peaks of equal
abundance. Thus, in a CE-SSCP profile, D’ will decrease when the abundance of a few peaks
increases and will increase when the areas of the highest peaks are replaced by a lot of minor
peaks.
The community structure of an ecosystem was defined as the list of species and their
relative abundance in the community (Begon et al., 1996). It has been shown that the
migration of ribotypes within the CE-SSCP capillary is highly reproducible (Zinger et al.,
2007). Therefore, the comparison of the peak sizes for each scan of the profile shows which
OTUs appear, disappear or change in abundance. Consequently, in the present paper, the
156
Etude expérimentale – Chapitre 2
study of the structure of bacterial communities refers to the fine analysis of the size of the
various peaks throughout the profiles.
4E
5
All statistical analyses were carried out using R version 2.6.1 (R development Core
Team, 2007). ANOVA was performed for diversity index (D’) using the following variables as
fixed effects: individual cow (five levels), sample type (four levels: ventral rumen, dorsal
rumen or reticulum contents and fæces), sampling week (three levels) and sampling hour after
meal (three levels). For environmental variables (pH and redox potential at 3 h after the meal,
VFA and NH3-N concentrations), the statistical model included individual cow and sampling
week as fixed effects. All possible interactions between previously cited factors were also
tested. Tukey's Honestly Significant Differences post-hoc tests (Tukey's HSD) were
performed. Correlations between diversity index as dependent variable and environmental
variables as independent variables were explored using General Linear Model (GLM) to
calculate Pearson’s R2.
4G
We calculated the pairwise Euclidean distances of the 50 CE-SSCP profiles. To
explore this distance matrix, non-metric MultiDimensional Scaling (nMDS) was performed
using 10000 random starts. Basically, nMDS is a two-dimensional display where each CESSCP profile is represented by a single point. They are plotted so as to respect as well as
possible with the Euclidian distance between each pair of points. The degree to which the
display matched the underlying distances was assessed by using Kruskal stress, a maximum
threshold value of 0.1 gives little risk of misinterpretation (Clarke & Warwick, 2001).
Analysis of similarity (ANOSIM) was performed on the distance matrix using 10000 Monte
Carlo permutations. Global ANOSIM was performed to test the fixed effects of individual
cow, sampling site, sampling week and sampling hour after the meal. Pairwise ANOSIM was
used to determine which level differed within a significant fixed effect. The factor tested was
considered to be not significant if P>0.05, whatever the value of ANOSIM R. The factor
tested was considered to be significant when P<0.05 and ANOSIM R>0.25. The value of
ANOSIM R indicates the degree of similarity between the groups (R>0.75: well separated
groups; 0.50<R<0.75: separated but overlapping groups; 0.25<R<0.50: separated but strongly
overlapping groups; Ramette, 2007). An iterative Mann-Whitney test on the 1200 scans of the
profile revealed which OTUs differed between two distinct communities.
157
Etude expérimentale – Chapitre 2
4H
F
Relationships between bacterial communities and environmental variables were tested
with a multivariate 50-50 F-test followed by a rotation test with 10000 permutations to assess
significance (Langsrud, 2002; Langsrud, 2005). The 1200 scans of CE-SSCP profiles were
treated as dependent variables and the environmental variables (pH and redox potential at 3 h
after the meal, VFA and NH3-N) as independent variables. This multivariate GLM test is
particularly suited to molecular fingerprint data as it is nonparametric, is effective for
collinear variables, is unaffected by the order of the independent variables (type II) and allows
the possibility of having more variables than observations.
8
Tableau 14. Effects of individual animal, week, and hour after meal in the ventral rumen and
effect of sampling site on the structure of bacterial communities using ANOSIM
CE-SSCP profile groups*
Degree of
P
proximity: R
Site of sampling
0.49
<0.001
Ventral rumen vs fæces
0.96
<0.05
Dorsal rumen vs fæces
0.96
<0.01
Reticulum vs fæces
1.00
<0.01
Ventral rumen vs dorsal rumen
0.02
NS†
Ventral rumen vs reticulum
0.10
NS
Reticulum vs dorsal rumen
-0.02
NS
0.51
<0.001
Wk 1 vs wk 2
0.88
<0.05
Wk 1 vs wk 3
0.11
NS
Wk 2 vs wk 3
0.50
<0.05
Sampling hour after meal
-0.06
NS
Individual cow in the ventral rumen
-0.10
NS
Sampling week in the ventral rumen
*The number of observation for all groups was 5.†NS non significant at P<0.05.
8
Ventral rumen content was relatively acid (pH = 6.5 ± 0.1) and reductive (redox
potential = -173 ± 32 mV). Acetic acid, propionic acid, butyric acid and NH3-N
158
Etude expérimentale – Chapitre 2
concentrations were 53.6 ± 8.4 mM, 11.2 ± 1.9 mM, 5.0 ± 0.7 mM and 93.7 ± 20.7 mg l-1
respectively. All parameters measured in the ventral rumen, apart from redox potential, varied
between animals (P<0.05; data not shown). However, environmental parameters did not
change between sampling weeks. No interaction was found between the effects of individuals
and sampling weeks (data not shown).
82
F
In the ventral rumen, the structure of the bacterial communities did not differ between
individual cows (Tableau 14). Likewise, the diversity index of the bacterial communities did
not differ between individual cows (Tableau 15). These findings meant that variability in the
diversity index and in the structure of bacterial communities in the ventral rumen did not
depend on the cow concerned.
Tableau 15. Effects of individual animal, week, hour after meal and sampling site on diversity
index of the bacterial communities
Simpson diversity index
P
Individual cow
Cow 1
Cow 2
Cow 3
Cow 4
Cow5
6.0 (0.6)
5.8 (0.7)
5.5 (0.5)
5.8 (0.3)
6.1 (0.6)
NS†
Sampling site
Ventral rumen
Dorsal rumen
Reticulum
Fæces
6.0 (0.7)
5.5 (0.4)
5.9 (0.3)
5.7 (0.3)
NS
Weeks
1st week
2nd week
3rd week
5.4 (0.3) a
6.1 (0.5) b
5.7 (0.5) a
t0
t3
t6
6.3 (0.6)
5.7 (0.5)
6.1 (0.4)
<0.01
Hour after meal*
NS
*t0, t3, t6 stand respectively for 0 h (before), 3 h and 6 h after meal. †NS means non significant at
P<0.05. Different letters (a, b, c) indicated that means differed at P<0.05. SD is given in brackets.
159
Etude expérimentale – Chapitre 2
84
The bacterial communities differed between sampling sites (ANOSIM R=0.49,
P<0.001; Tableau 14). The structure of the bacterial communities differed greatly between
samples from fæces and from the forestomach regions, i.e. the ventral rumen, dorsal rumen
and reticulum (ANOSIM R>0.96, P<0.05; Tableau 14; Figure 31). Differences between
forestomach and fæces concerned numerous OTUs located throughout the profiles (Figure
32A). Indeed, 61 % of the scans of the CE-SSCP profiles differed significantly between the
bacterial communities of forestomach and fæces. Bacterial community structures did not
differ either between ventral and dorsal rumen or in the reticulum (Tableau 14). The diversity
index did not differ among the four sample types of the digestive tract (Tableau 15).
Stress* = 0.098
Forestomach
Fæces
Figure 31. Two-dimensional nMDS plot of the 50 CE-SSCP profiles from the 1st (○), 2nd (●) and
3rd (●) weeks.
Black ellipses clustered the CE-SSCP profiles sampled from forestomach and fæces.
160
Etude expérimentale – Chapitre 2
Signal intensity
A
Mean of forestomach CE-SSCP profiles
Mean of fæces CE-SSCP profiles
Significant difference
4
2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1000
1200
1000
1200
Scans of fingerprint profiles
Signal intensity
B
Mean of 1st week CE-SSCP profiles
Mean of 2nd week CE-SSCP profiles
Significant difference
4
2
0
0
200
400
600
800
Scans of fingerprint profiles
Signal intensity
C
Mean of 3rd week CE-SSCP profiles
Mean of 2nd week CE-SSCP profiles
Significant difference
4
2
0
0
200
400
600
800
Scans of fingerprint profiles
Figure 32. Structure differences on average CE-SSCP profiles between two distinct bacterial
communities: forestomach vs fæces (A), 1st vs 2nd week (B) and 2nd vs 3rd week (C).
Structure differences at P<0.05 are indicated by black horizontal lines.
161
Etude expérimentale – Chapitre 2
88
F
F
I
In the ventral rumen, the bacterial community structure differed between sampling
weeks (ANOSIM R=0.51, P<0.001; Tableau 14). In this study, the bacterial community
structure of the 2nd week differed from those of the 1st and 3rd weeks (ANOSIM R=0.88, 0.50
for 2nd week vs 1st and 3rd week respectively; P<0.05). This difference occurred sporadically
along the profile. Indeed 32% and 18% of OTUs differed significantly between the 2nd week
and respectively the 1st (Figure 32A) and 3rd week (Figure 32B).
The diversity index was also different between weeks, with a higher value for the 2nd
week than for the 1st and 3rd weeks (P<0.01; Tableau 15). The structure and the diversity
index of the bacterial community of the ventral rumen did not change significantly during the
6 hours following the meal (Tableau 14, Tableau 15).
Tableau 16. Effects of environmental parameters on the structure of the bacterial community of
the ventral rumen 3 h after a meal using 50-50 F-test
d.f.
Explained
variance (%)
P
pH
1
9.6
NS†
Redox potential (mV)
1
5.1
NS
Acetic acid (mM)
1
6.6
NS
Propionic acid (mM)
1
7.0
<0.01
Butyric acid (mM)
1
8.2
NS
NH3-N (mg l-1)
1
12.2
<0.05
Residuals
8
51.3
†NS non significant at P<0.05.
8:
F
The 15 CE-SSCP profiles sampled in the ventral rumen 3 h after a meal were selected
for analysis as they correspond to the entire set of environmental parameters data available.
The structure of the bacterial community of the ventral rumen was correlated with propionic
acid (7 %, P<0.01) and NH3-N concentrations (12 %, P<0.05; Tableau 16). The Simpson
diversity index of the bacterial community of the ventral rumen was correlated (R²=0.23,
P<0.05) with the NH3-N concentration (Tableau 17).
162
Etude expérimentale – Chapitre 2
Tableau 17. Correlations between environmental parameters and diversity index of the bacterial
community of the ventral rumen 3 h after a meal
Pearson R²
P
pH
0.15
NS†
Redox potential (mV)
0.03
NS
Acetic acid (mM)
0.03
NS
Propionic acid (mM )
0.04
NS
Butyric acid (mM)
0.00
NS
NH3-N (mg l-1)
0.23
<0.05
†NS non significant at P<0.05.
:
In this work, CE-SSCP profiles of the V3 region of 16S rRNA genes were used to
study the spatial changes, dynamic and inter-animal variation of the bacterial community of
the bovine digestive tract. The results showed that the bacterial community was primarily
influenced by the sampling site. Indeed, we showed that forestomach and fæces harbored very
different bacterial communities. In the rumen, the bacterial community was correlated with
some environmental parameters like propionic acid and NH3-N concentrations. Bacterial
communities also varied with time as shown by the sampling week effect. On the other hand
we found no influence either of the host individual or of the time after the meal on the
structure and diversity of the bacterial community.
The diversity index of bacterial communities was similar whatever the sampling site
(mean 5.8 ± 0.5) but higher than that observed in the rabbit cæcum (3.8 ± 0.5) using the same
estimator (Michelland et al., 2008). However, the structure of the bacterial communities
differed greatly between forestomach and fæces. Differences between these two communities
occurred throughout the profile of the bacterial community and for almost all OTUs. Similar
results were observed throughout the gastrointestinal tract of domestic animals (Lin et al.,
1997; Simpson et al., 1999), and man (Marteau et al., 2001; Zoetendal et al., 2002b). Our
result could be explained by the origin of the samples: the rumen is in the anterior part of the
digestive tract while fæces are excreted at the end of the digestive tract. Therefore,
environmental conditions like pH and degree of anaerobiosis, but also source and amount of
substrate, are well known to vary greatly. Due to differences in the structure of the bacterial
community between rumen and fæces, the study of both rumen and large intestine in future
163
Etude expérimentale – Chapitre 2
experiments would permit a more global approach to the bovine digestive ecosystem and open
up additional possibilities for controlling and managing digestion in herbivorous mammals.
Within the forestomach we observed no differences in the structures and diversity
indexes of bacterial communities between ventral rumen, dorsal rumen and reticulum.
However, the ventral rumen contains both solid fiber particles and fluid falling by gravity
whereas the dorsal rumen contains mainly solid fiber particles. Furthermore, studies based on
fingerprint methods (Larue et al., 2005; Sadet et al., 2007) or 16S rRNA gene library
sequences (Cho et al., 2006) showed that the solid particles and the ruminal juice harbor two
very different bacterial communities. The solid particles contained mainly fibrolytic bacteria
attached to particles. In our study, the whole bacterial community was analyzed, which could
explain the similar bacterial communities at different sample sites. Indeed, ruminal
contractions tend to continuously mix the rumen content. In future investigations it would be
interesting to dissociate the solid and liquid phases in the ventral and dorsal compartments of
the rumen.
Our results showed that neither diversity index nor structure of the bacterial
communities differed between individual cows. Sadet et al. (2007) obtained a similar result.
Studying two groups of four lambs receiving different food, they observed that DGGE
patterns of bacterial communities were clustered primarily according to diet and sample type
(location in the forestomach, liquid or solid phase) and then according to the individual
animal. However the current opinion is that the bacterial community of the digestive tract is
specific to each individual, suggesting a strong interaction between the host and its bacterial
communities (dog: Simpson et al., 2002 ; man: Zoetendal et al., 1998; sheep: Edwards et al.,
2005). Consequently, in studies like ours where several sources of variation are studied
simultaneously, the absence of an effect of individual can mean that variability between CESSCP profiles for different samples of a given individual cow is greater than variability
between individual cows.
In our study, the diversity index and the structure of the bacterial communities were
similar in the 1st and 3rd week but different from those of the 2nd week. This result could
reflect either stochastic events or the occurrence of non-measured disturbances affecting
specific OTUs, since all the environmental parameters measured 3 hours after the meal
remained constant during the three weeks of the trial. In contrast, Edwards et al. (2005) did
not observe evolution of the ruminal bacterial community in four sheep studied over fifteen
days. Fernandez et al. (1999) previously demonstrated that a stable ecosystem function can
164
Etude expérimentale – Chapitre 2
hide a chaotic evolution of the different OTUs constituting a community. A better
comprehension of both the possible amplitude of, and the phenomena underlying such a
temporal variation could improve control of the digestive process in ruminants. The present
results showed no modification either of the structure or of the diversity index of the bacterial
community of the ventral rumen after the meal.
In our study we observed significant correlations between environmental parameters
and structure or diversity of bacterial communities, but the amount of variance that
environmental parameters explained is limited. Propionic acid and NH3-N concentrations of
the ventral rumen were correlated to the structure of the bacterial community, whereas only
NH3-N concentration was correlated to the diversity index. The reductive conditions
(measured by redox potential) and acidity (pH) of the ventral rumen are usually regarded as
important parameters selecting bacterial species (Kamra, 2005). Strikingly, in our study
neither pH nor redox potential were correlated with the structure or the diversity index of the
bacterial community of the ventral rumen. These two environmental parameters did not
change between sampling weeks, probably due to the high fiber and low starch content of the
meal, known to maintain ruminal pH and redox potential (Allen, 1997).
Ecologically, a greater diversity is often considered to be a positive attribute for a more
stable and resilient microbial community. Indeed, diversity allows functional redundancy,
meaning that even if disturbances affect some bacterial species, several others can provide the
same services to maintain the ecosystem’s functioning (Cardinale et al., 2002; Zoetendal et
al., 2004). In our work, the diversity index seemed an interesting global indicator as it allowed
us to demonstrate the dynamic of bacterial communities. It failed to differentiate the bacterial
communities of forestomach and large intestine, confirming that the two communities could
have the same diversity index while harboring very different structures. Therefore, for finer
characterization of a microbial community using molecular fingerprints, the diversity index
should be coupled with the analysis of the structure of the bacterial community.
In conclusion, the present experiment demonstrated both spatial and temporal
variations in the bacterial communities residing in the bovine digestive tract. Consequently,
future studies on digestive ecosystems in ruminants should be widened from the rumen to
other parts of the digestive tract, such as the reticulum and large intestine. Secondly, our
results showed that the bacterial communities can evolve spontaneously from week to week in
the absence of controlled disturbances. The reasons for this need to be elucidated.
165
Etude expérimentale – Chapitre 2
E
I
F
The authors thank Sébastien Dejean, Institut de Mathématiques of Paul Sabatier
University of Toulouse, France, for assistance with statistical analyses. The authors are
grateful to technical assistance in the laboratory from Carole Bannelier, Béatrice Gabinaud,
Muriel Segura, Véronique Tartie and the staff at the breeding center. The work of the staff at
the Centre de Ressources, Génotypage et Séquencage of Toulouse is gratefully acknowledged.
166
Etude expérimentale – Chapitre 2
G
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170
Etude expérimentale – Chapitre 2
/
Rory J. Michelland, Sylvie Combes, Valérie Monteils, Laurent Cauquil, Thierry Gidenne,
Laurence Fortun-Lamothe
In press dans Anaerobe
Mots clés : bactéries, cæcum, fèces, indice de diversité, structure
Résumé
Le but de ce travail était d’étudier la stabilité temporelle des communautés
bactériennes du cæcum et des fèces du lapin (indice de diversité et structure) en l’absence de
perturbation expérimentale et d’évaluer ces relations avec les paramètres environnementaux.
Des cæcotrophes et des crottes dures de 14 lapins ont été prélevés pendant 5 semaines tandis
que du contenu cæcal a été prélevé la 3ème semaine (par chirurgie) et la 5ème semaine (après
sacrifice). Les communautés bactériennes ont été étudiées en analysant les profils CE-SSCP
des gènes codant pour l’ARNr 16S. Le potentiel redox, le pH, les concentrations en NH3-N et
en acides gras volatiles ont été mesurées dans le cæcum. Les données montrent que les
communautés bactériennes des cæcotrophes et des crottes dures diffèrent légèrement de celle
du cæcum (ANOSIM-R<0.25; p<0.05). En l’absence de perturbation, les communautés
bactériennes des fèces sont stables dans le temps (ANOSIM-R<0.25; p<0.001). En revanche,
les communautés bactériennes du cæcum et des fèces ont été affectées par l’opération
chirurgicale réalisée en 3ème semaine (ANOSIM-R=0.22 à 0.33; p < 0.001). Le contenu cæcal
est un environnement acide (pH = 6.03 ± 0.33) et anaérobique (potentiel redox = -160 ± 43
mV). Seul le potentiel redox est corrélé à l’indice de diversité des communautés bactériennes
du cæcum (R²=0.35; p<0.05) et aucun des paramètres du milieu étudiés n’a été corrélé à sa
structure.
171
Etude expérimentale – Chapitre 2
172
Etude expérimentale – Chapitre 2
/
/
In press in Anaerobe
Rory J. Michelland 1,2,3, Sylvie Combes 1,2,3, Valérie Monteils 2,1,3, Laurent Cauquil 1,2,3,
Thierry Gidenne 1,2,3, Laurence Fortun-Lamothe 1,2,3
1
INRA, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème et Métabolisme, F-
31326 Castanet-Tolosan, France
2
Université de Toulouse, INPT ENSAT, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion
Ecosystème et Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France
3
ENVT, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème et Métabolisme, F-
31076 Toulouse, France
Corresponding author: Laurence Fortun-Lamothe. Address: INRA, Université de Toulouse,
UMR 1289, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et Métabolisme, Chemin de
Borde-Rouge, Auzeville, BP 52627, F-31326 Castanet-Tolosan Cedex, France. Phone: 33 (5)
61 28 53 18. Fax: 33 (5) 61 28 53 18. E-mail: Laurence.Lamothe@toulouse.inra.fr
173
Etude expérimentale – Chapitre 2
174
Etude expérimentale – Chapitre 2
This work aimed to study the stability over time of the bacterial community in cæcum
and fæces of the rabbit (diversity index and structure) without experimental disturbance and to
evaluate its relationships with environmental parameters. Soft and hard fæces of 14 rabbits
were sampled for 5 weeks while cæcal content was sampled on the 3rd week (by surgery) and
the 5th week (at slaughter). Bacterial communities were assessed by studying CE-SSCP
profiles of 16S rRNA genes fragments. Redox potential, pH, NH3-N concentration and
volatile fatty acid concentrations were measured in the cæcum. Data showed that bacterial
communities of soft and hard fæces barely differed from that of the cæcum (ANOSIMR<0.25; p<0.05). Without disturbance, the bacterial communities of fæces were stable over
time (ANOSIM-R<0.25; p<0.001). However, the bacterial communities of cæcum and fæces
were affected by the surgery (ANOSIM-R=0.22 to 0.33; p < 0.001). The cæcal content was an
acidic (pH = 6.03 ± 0.33) and an anaerobic environment (redox potential = -160 ± 43 mV).
Only the redox potential was correlated with the diversity index of the bacterial community of
the cæcum (R²=0.35; p<0.05) and no environmental parameters were correlated to its
structure.
Keywords : bacteria, cæcum, fæces, diversity index, structure
175
Etude expérimentale – Chapitre 2
176
Etude expérimentale – Chapitre 2
2
In intensive rabbit breeding, digestive disorders are responsible for a high mortality
rate, mainly during the period following weaning. In rabbits, the bacterial community of the
digestive tract, and more especially of the cæcum, plays a major role in the health of the gut
and in digestive efficiency (Gouet & Fonty, 1979). Therefore a better knowledge of the
bacterial community of the cæcum is required to reduce the losses occurring in rabbit farming.
The cæcal microbial community has been mainly studied using culture techniques
(Gouet & Fonty, 1979). But such techniques reveal only 20 to 40% of the real bacterial
richness (Suau et al., 1999). Few studies used culture-independent analysis of 16S rRNA
genes. They demonstrated that the rabbit’s cæcum harbors 80% to 96% of unknown bacterial
species (Abecia et al., 2005; Monteils et al., 2008) and contains no anaerobic fungi and a
higher proportion of Archaea than in the cow’s rumen (Bennegadi et al., 2003). The bacterial
community contained a majority of Firmicutes (93%) and Bacteroidetes (4%; Monteils et al.,
2008). However, to our knowledge, variability of the cæcal bacterial community has never
been studied for individual animals over time.
Rabbits belong to the rare cæcotrophic herbivorous species. The finest particles in the
cæcum are selected continuously by antiperistaltic movements towards the cæcum and
proximal colon to form soft fæces. Unlike hard fæces which are excreted, soft fæces are
excreted and eaten by the rabbit, providing a protein and vitamin supply of bacterial origin.
This particular digestive strategy contrasts with those of previously studied herbivores: the
forestomach of ruminants (Tajima et al., 1999), the large intestine of horses (Daly et al.,
2001) or the hindgut of termites (Schmitt-Wagner et al., 2003). This suggests that the
microbial community in the rabbit cæcum could differ from those of soft and hard fæces but
also from those of digestive tract in other herbivores.
This study aimed i) to explore the stability over time of bacterial communities of cæcal
content, soft and hard fæces using Capillary Electrophoresis Single-Strand Conformation
Polymorphism (CE-SSCP), and ii) to establish relationships between the cæcal bacterial
community and the cæcal environmental parameters (pH, redox potential, and volatile fatty
acid concentrations).
177
Etude expérimentale – Chapitre 2
4
4
5
In the experimental unit of UMR 1289 INRA TANDEM, fourteen 12-week-old white
New Zealand x Californian rabbits were maintained in individual cages in a controlled
environment during the five experimental weeks. The rabbits were fed ad-libitum a standard
diet (18 % crude protein; 2.0 % crude fat; 14.2 % crude fiber; 19.4 % starch; 16.5% ADF)
containing neither antibiotics nor coccidiostatics and had free access to fresh water. The
rabbits were adapted to the diet 2 weeks before sampling. Animals were cared for in
accordance with the guidelines for animal research of the French Ministry of Agriculture
(Anonymous, 27 avril 1988).
Soft and hard fæces were collected once a week between 09:00 and 12:00 during 5
consecutive weeks on fixed days. Soft fæces were collected by placing a light plastic collar
round the neck on the day of sampling (Gidenne & Lapanouse, 2000). To avoid stress, rabbits
were familiarized with the collar several times during the 14 days before the experiment.
Cæcal contents were collected surgically on the 3rd week as described by Bellier et al. (1995)
and on the 5th week, after slaughtering by means of an overdose of thiopental (Nesdonal,
Rhone Merieux) preceded by anesthesia (0.5 ml/kg Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany
and 0.4 ml/kg Imalgène, Rhône Merieux). Surgery and slaughtering were performed just after
collection of soft and hard fæces. On certain days some rabbits did not excrete soft (n=9) or
hard fæces (n=1). A total of 158 samples were collected and immediately stored at -20°C until
analysis.
42
Environmental parameters were determined on the 5th week only. The cæcal pH and
redox potential were recorded after anesthesia according to Kimsé et al. (2008).
Measurements were recorded after 15 min for stabilization. A combined electrode was used to
measure pH (Unitrode with Pt 1000; Metrohm, Heriseau, Switzerland). Redox potential was
measured with a platinum electrode using Ag/AgCl as reference (combined Pt-ring electrode;
Metrohm, Heriseau, Switzerland). The data obtained were corrected by adding the potential of
the reference hydrogen electrode: +199 mV (Nordstrom, 1977). Concentrations of volatile
fatty acids (VFA) were determined by automated gas separation (5890A, Hewlett Packard,
Avondale, PA; Playne, 1985). NH3-N concentrations were determined by a colorimetric
method as previously described by Hach et al. (1987).
178
Etude expérimentale – Chapitre 2
44
K
5
Total DNA was extracted and purified with QIAamp® DNA Stool Mini kit (Qiagen,
Hilden, Germany) from about 0.2 g of sample. The V3 region of the 16S rRNA genes,
corresponding to a 205 bp fragment in Escherichia coli, was used as a diversity marker by
performing PCR using the primers w49 5'-ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3' and 5’6FAM-labeled w34 5'- TTACCGCGGCGTGCTGGCAC-3' (Delbès et al., 1998; Zumstein et
al., 2000). PCR was carried out in a 50 µL reaction mixture containing 5 µL 10× buffer, 0.2
µM of each primer, 200 µM of each dNTP, 0.25 U Pfu Ultra II Fusion HS DNA polymerase
(Stratagene, La Jolla, California, USA), 25 µg bovine serum albumin (New England Biolabs,
Ipswich, Massachusetts, USA) and 1 µL of 200 times diluted DNA extract. The PCR program
consisted of 2 min at 95°C, 30 cycles with 30 s at 94°C, 30s at 61°C, 30s at 72°C followed by
a final extension at 72°C for 3 min. PCR product was checked for appropriate size by 1%
agarose gel electrophoresis. The CE-SSCP mix contained 1 µL of PCR product, 7.8 µL of
deionized formamid (Genescan, Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) and 0.2
µL of the internal standard labelled with 6-carboxy-X-rhodamine (ROX HD400, Applied
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). The mixture was denatured at 95°C for 5 min
and placed on ice before loading. CE-SSCP was performed on an ABI Prism 3100 Genetic
Analyzer using a 36 cm long capillary and a 7.2% non-denaturing polymer consisting of 80%
CAP polymer (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA), 10% glycerol and 10%
10xTBE buffer (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). Electrophoresis was
performed at 25°C for 3500 s at 15 KV. CE-SSCP produced 22000 scans chromatogram
containing both sample and internal standard signal. The bacterial community was spread out
in about 1200 scans. Events of co-migration of ribotypes belonging to different bacterial
species may occur during capillary electrophoresis resulting in a single peak on the CE-SSCP
profile (Zinger et al., 2007). Thus we preferred to assume that a single peak corresponds to an
operational taxonomic unit (OTU) assembly rather than to a single ribotype or a bacterial
species. CE-SSCP profiles were aligned and normalized with SAFUM version 4.4 software
running on Matlab version 6.0 (Zemb et al., 2007).
48
5
The diversity index is estimated by summarizing a complex community represented in
a molecular fingerprint pattern by a single value by taking into account the number of species
(number of peaks) and their relative abundance (area under each peak). The Simpson diversity
179
Etude expérimentale – Chapitre 2
index was estimated as the negative logarithm of the Simpson index, designated D'
(Rosenzweig, 1995).
The community structure of an ecosystem has been defined as a list of the species and
their relative abundance in the community (Begon et al., 1996). It was demonstrated that the
migration of ribotypes within the CE-SSCP capillary is highly reproducible (Zinger et al.,
2007). Therefore comparison of the peak size for each scan of the profile shows which OTUs
appear or disappear, or whose abundance has changed. Consequently, in the present paper, the
study of the structure of the bacterial communities refers to the fine analysis of the size of the
various peaks throughout the profiles.
4:
All statistical analyses were carried out using R version 2.6.1 (R development Core
Team, 2007). The diversity index was subjected to analysis of variance (ANOVA) and
Tukey's HSD post-hoc test using individual animal, sample type, sampling week and
interactions as fixed effects. This ANOVA model was applied to two data sets because cæcal
content was not sampled in the 1st, 2nd and 4th weeks. To begin with, the data from cæcal
content were excluded from analysis to determine the stability over time of the bacterial
diversity index in fæces. Next, the data from the 1st, 2nd and 4th weeks were excluded from the
analysis to compare the bacterial diversity index in the cæcum and fæces and to determine the
influence of the individual animal. Pearson correlation coefficients between diversity index
and pH, redox potential and VFA were calculated.
To study the structure of the bacterial communities, we calculated the pairwise
Euclidean distances between the 158 CE-SSCP profiles. To explore this distance matrix, nonmetric MultiDimensional Scaling (nMDS) was performed using 10000 random starts (Clarke,
1993). nMDS produced a two-dimensional display where each CE-SSCP profile was
represented by a single plot. Analysis of similarity (ANOSIM) was performed on the distance
matrix using 10000 Monte Carlo permutations. Global ANOSIM was performed to test the
effects of sample type (cæcal content, soft and hard fæces) and then to test within the three
sample types, the individual and week effects. Pairwise ANOSIM was used to determine
which levels differed within a significant fixed effect (P-value<0.05). The ANOSIM-R value
indicated the extent to which the groups differed (R>0.75: well separated groups;
0.50<R<0.75: separated but overlapping groups; 0.25<R<0.50: separated but strongly
overlapping groups; 0.25<R: barely separated groups; Ramette, 2007). An iterative Mann-
180
Etude expérimentale – Chapitre 2
Whitney test on the 1200 scans of the CE-SSCP profiles identified the OTU assemblies which
differed between the two distinct communities.
Relationships between bacterial communities and environmental variables were
studied using multivariate 50-50 F-test followed by a rotation test to assess significance
(Langsrud, 2002; Langsrud, 2005). The 1200 scans of CE-SSCP profiles were treated as
dependent variables and the environmental variables (pH, redox potential and VFA) as
independent variables.
a
a
a
a
a
a
4.0
4.2
4.4
8
a
3.8
b
b
3.6
b
b
3.4
Cæcal content
Soft fæces
Hard fæces
1
2
b
3
4
5
Surgery
Figure 33. Dynamics of the Simpson diversity index for cæcal content and soft and hard fæces.
Within a sample type, means with different letters were significantly different at p<0.05.
181
Etude expérimentale – Chapitre 2
8
;
At slaughtering, the full cæcum represented 4.2 ± 0.7% of the rabbit body weight. The
cæcal content was an acidic (pH = 6.03 ± 0.33), reductive (redox potential = -160 ± 43 mV)
and humid (water content = 76 ± 9%) environment. Acetic, propionic and butyric acid
concentrations were 64.9 ± 18.5 mM, 4.1 ± 1.3 mM and 11.3 ± 4.9 mM respectively.
Tableau 18. Effect of individual and sampling week on the bacterial community of cæcum, soft
and hard fæces using global and pairwise ANOSIM statistical test.
Effect
Degree of
Significance of R
similarity: R
0.16
<0.001
Cæcal content (n=28) vs soft fæces (n=61)
0.13
<0.05
Cæcal content (n=28) vs hard fæces (n=69)
0.24
<0.001
Soft (n=61) vs hard fæces (n=69)
0.15
<0.001
Individual
0.15
NS1
3rd (n=14) vs 5th weeks (n=14)
0.22
<0.001
Individual
0.13
<0.001
Between 1st (n=12), 2nd (n=11), 3rd (n=14) weeks
<0.08
NS
4th (n=12) vs 5th (n=12) weeks
-0.05
NS
1st, 2nd, 3rd (n=37) vs 4th, 5th (n=24) weeks
0.33
<0.001
0.17
<0.001
<0.07
NS
-0.02
NS
0.30
<0.001
Sample type
Cæcal content
Soft fæces
Hard fæces
Individual
st
nd
rd
Between 1 (n=14), 2 (n=14), 3 (n=14) weeks
th
th
4 (n=14) vs 5 (n=14) weeks
st
nd
rd
th
th
1 , 2 , 3 (n=42) vs 4 , 5 (n=28) weeks
1
NS, non-significant R value at p<0.05.
82
;
K
;
The diversity index of bacterial communities of cæcal content (4.0 ± 0.5), soft (3.9 ±
0.5) and hard fæces (4.1 ± 0.4) were not significantly different (Figure 33). CE-SSCP profiles
were barely separated according to sample type (ANOSIM-R=0.16; p<0.001; Tableau 18,
Figure 34). The bacterial community structure of cæcal content was closer to that of soft
fæces than of hard fæces (ANOSIM-R=0.13 and 0.24 respectively; p<0.05; Tableau 18).
182
Etude expérimentale – Chapitre 2
Differences in bacterial community structure between cæcal content and soft fæces occurred
sporadically along the profile and applied to few OTU assemblies (17% of the profile; Figure
35). Conversely, the differences between cæcal content and hard fæces occurred more
extensively along the profile (41% of the profile).
Stress= 0.183
Cæcal content after surgery
Soft fæces before surgery
Soft fæces after surgery
Hard fæces before surgery
Hard fæces after surgery
Figure 34. Two-dimensional nMDS plot of the 158 CE-SSCP profiles set according to sample
type and surgery.
84
CE-SSCP profiles of cæcal content did not cluster according to the rabbit from which
they came (Tableau 18). Those from soft and hard fæces barely clustered for individuals
(ANOSIM-R=0.13, 0.17 respectively; p<0.001). Bacterial diversity index varied between
individuals (p<0.001) but this effect was due to a single rabbit (data not shown).
48
CE-SSCP profiles of soft and hard fæces sampled from the 1st to the 3rd weeks did not
cluster according to sampling week (Tableau 18). Similarly, bacterial diversity indexes of soft
183
Etude expérimentale – Chapitre 2
and hard fæces were similar between the 1st and 3rd weeks (Figure 33). Conversely, the
comparison of the profiles before (1st, 2nd and 3rd weeks) and after surgery (4th and 5th weeks)
demonstrated that surgery to sample cæcal content greatly affected the bacterial community
structure in both cæcum and fæces (ANOSIM-R=0.22, 0.33, 0.30 respectively for cæcal
content, soft and hard fæces; p<0.001; Tableau 18). The differences in the bacterial
community of cæcal content before and after surgery applied to numerous OTU assemblies
located throughout the profiles (Figure 35). Indeed, 67 % of these scan values differed
between the 3rd and the 5th week (Figure 35). Bacterial community diversity indexes of the
cæcum and fæces decreased after surgery (3.7 ± 0.4 and 4.2 ± 0.4 respectively; p<0.001;
Relative abundance 10³
Figure 35).
6
Mean of cæcal content CE-SSCP profiles before surgery
Mean of soft fæces CE-SSCP profiles before surgery
Mean of hard fæces CE-SSCP profiles before surgery
A
4
2
0
α
β
0
200
400
600
800
1000
1200
Relative abundance 10³
Scan of CE-SSCP profile
6
Mean of 3rd week cæcal content CE-SSCP
profiles
Mean of 5th week cæcal content CE-SSCP
B
4
profiles
2
0
0
200
400
600
800
Scan of CE-SSCP profile
1000
1200
Figure 35. Structure differences of bacterial community between cæcal content, and soft and
hard fæces before surgery (A) and effect of surgery in bacterial community structure in cæcal
content (B).
Structure differences at p<0.05 were indicated by black horizontal lines. α, β: structure differences
with cæcal content and soft and hard fæces respectively.
184
Etude expérimentale – Chapitre 2
8:
F
;
In the cæcum, among the environmental parameters measured in the 5th week, only the
redox potential was negatively correlated to the bacterial diversity index (R²=0.35; p<0.05).
Redox potential, pH and VFA were not correlated to the bacterial structure (NS).
:
In the present work we compared bacterial communities in the cæcum and in the soft
and hard fæces of adult rabbits using CE-SSCP profiles of 16S rRNA gene fragments. The
results showed that the diversity index was similar in the three communities and that the
structure of the bacterial community of cæcal content was close to that of soft fæces. Without
disturbance, the bacterial community structure and diversity index of fæces were stable.
However, the surgical operation used to sample cæcal content affected the bacterial
communities of both the cæcum and the fæces.
These results show that the diversity index of the bacterial community of the cæcum in
adult rabbits was 3.8 ± 0.5. This is lower than has been observed in the bovine rumen using
the same method (5.8 ± 0.5; Michelland et al., 2007). The diversity index was similar between
the cæcum and the two types of fæces. We also showed that the structure of the bacterial
community in the cæcum is close to that in soft fæces and to a lesser extent to that in hard
fæces. This may be linked with the digestive physiology and anatomy of the rabbit (Carabaño
& Piquer, 1998). Indeed, soft fæces correspond to a slightly modified cæcal content which is
excreted after a simple transit through the large intestine. Moreover, the cæcum is located at
the end of the digestive tract, just before the large intestine where hard fæces are produced.
The results obtained before surgery demonstrated that both the diversity index and the
structure of bacterial communities in soft and hard fæces did not change over time. This
stability of the bacterial community in the gastrointestinal ecosystem was also observed over
fifteen days in the sheep’s rumen (Edwards et al., 2005). Our results could be explained by i)
the age of the animals, since cæcal fermentative activity has been shown to be fully developed
from 6 weeks of age (Gidenne et al., 2002), and ii) the highly controlled environment of
breeding which limits exposure to microorganisms and provides a constant diet to the
animals. The stability of the bacterial community meant that its resilience to a challenge could
be studied (e.g. nutrition, feed additives or drugs). The surgical procedure used to sample
cæcal content greatly affected the diversity index and the structure of the bacterial
communities in the cæcum and in the soft and hard fæces. Consequently, the study of the
185
Etude expérimentale – Chapitre 2
bacterial community in the cæcum over time is difficult since access to this ecosystem
disturbs the animals. Gidenne et al. (1993) tested fistulation of the cæcum in rabbits to study
cæcal fermentation. This technique avoids operating on the animals for each sampling but
each opening of the fistula may disturb the bacterial community as oxygen enters. Our results
show a link between the bacterial community of the cæcum and the highly reductive condition
in the cæcum, as measured by the Eh. Indeed, the more reductive was the cæcal redox
potential, the higher was the diversity index of the bacterial community in the cæcum.
Besides, oxygen entry into the cæcum during surgery may explain the fall in the diversity
index observed between the 3rd and the 4th week. The present results suggest that soft, and to a
lesser extent hard fæces, could be a useful alternative to surgery to monitor changes in the
cæcal bacterial community. Hence future studies will be easier and ethically more acceptable,
since slaughter or surgery will no longer be necessary.
None of the environmental parameters studied were correlated with the structure of the
bacterial community in the cæcum. This lack of a clear relationship between the bacterial
community and the measured environmental parameters could be due to the high buffering
capacity of the cæcal content (Ding et al., 1997) and the relatively constant composition of the
material entering the cæcum. Indeed, the rabbit is a monogastric animal whose food is
hydrolyzed in the stomach and small intestine before entering the cæcum.
In the cæcum, the structure of the bacterial community did not differ between rabbits.
These results suggest either that i) the host has little impact on the bacterial community or ii)
the strong control of the extrinsic parameters (diet, housing) and the genetic similarity
between individuals belonging to the same selected rabbit strain shaped the bacterial
community in the same way. Similar results were recently observed in prepubescent turkeys
(Scupham, 2007), but in the sheep’s rumen, the bacterial community has been reported to be
highly specific to each animal, the influence of the individual being larger than any other
tested effects such as antibiotic treatment (Edwards et al., 2005) or diet (Larue et al., 2005).
E
In conclusion, in the absence of disturbance, the fæcal bacterial communities in adult
rabbits were stable over time. This stability means that their resilience to a challenge (e.g.
nutrition, feed additives or drugs) can be studied in the future. Environmental parameters were
poorly related to microbial community of cæcum. Soft and to a lesser extent hard fæces, have
186
Etude expérimentale – Chapitre 2
bacterial communities close to that of the cæcum and can be used instead of cæcal content to
monitor changes in the cæcal bacterial community of the rabbit.
G
I
F
The authors are grateful to technical assistance in the laboratory Carole Bannelier,
Béatrice Gabinaud, Muriel Segura, Véronique Tartie and in the breeding center Patrick
Aymard, Jacques De Dapper, Jean De Dapper, André Lapanouse. The work of the staff at the
Centre de Ressources, Génotypage et Séquencage of Toulouse is gratefully acknowledged.
187
Etude expérimentale – Chapitre 2
H
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190
Etude expérimentale – Chapitre 2
1
Rory Julien Michelland, Valérie Monteils, Sylvie Combes, Laurent Cauquil, Thierry Gidenne,
Laurence Fortun-Lamothe
Mots clés: Archaea, structure, rumen, fèces, cæcum, indice de richesse
Titre abrégé: les communautés d’Archaea dans les systèmes digestifs
Résumé
L’objectif de ce travail était de comparer les communautés d’Archaea dans le tube
digestif de deux modèles animaux qui possèdent des spécificités digestives. Pour cela, les
communautés d’Archaea dans les fermenteurs digestifs et les fèces de la vache et du lapin ont
été comparées par analyse des profils CE-SSCP (Capillary Electrophoresis Single-Stranded
Conformation Polymorphism) obtenus après amplification des gènes codant pour l’ARNr
16S. Des échantillons de contenu ruminal et fécal ont été prélevés chez 5 vaches durant 3
semaines. Des crottes dures et des cæcotrophes ont été prélevés chez 14 lapins durant 3
semaines et des échantillons des contenus cæcaux ont été prélevés la 3ème semaine par voie
chirurgicale. Nos résultats montrent que les communautés d’Archaea diffèrent entre les deux
espèces modèles et entre les compartiments au sein du tube digestif. Chez les deux espèces,
les communautés d’Archaea sont stables au cours du temps et varient très peu entre les
individus. La similarité des communautés d’Archaea entre le contenu cæcal et les
cæcotrophes nous permet d’utiliser les cæcotrophes comme une matrice alternative
représentative du contenu cæcal. En conclusion, la communauté d’Archaea diffère entre les
mammifères herbivores et à l’intérieur de leur tube digestif mais ont en commun une stabilité
dans le temps et une faible variabilité individuelle.
191
Etude expérimentale – Chapitre 2
192
Etude expérimentale – Chapitre 2
/
<
Rory Julien Michelland 1,2,3, Valérie Monteils 2,1,3, Sylvie Combes 1,2,3, Laurent Cauquil
1,2,3, Thierry Gidenne 1,2,3, Laurence Fortun-Lamothe 1,2,3
1 INRA, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème et Métabolisme, F31326 Castanet-Tolosan, France
2 Université de Toulouse, INPT ENSAT, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion
Ecosystème et Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France
3 ENVT, UMR1289 Tissus Animaux Nutrition Digestion Ecosystème et Métabolisme, F31076 Toulouse, France
Running title: digestive archaeal community
Corresponding author. Name : Valérie Monteils. Mailing address: Ecole Nationale Supérieure
Agronomique de Toulouse, UMR 1289, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme,
BP
32607,
F-31326
Castanet
Tolosan
Cedex,
France.
E-mail:
valerie.monteils@ensat.fr. Phone: 33 (5) 62 19 39 09. Fax: 33 (5) 62 19 39 01.
193
Etude expérimentale – Chapitre 2
194
Etude expérimentale – Chapitre 2
Aims: Studying of the archaeal community in the digestive tract of two animal models with
different digestive specificities.
Methods and Results: The archaeal community in the fermentative compartment and faeces
of the cow and the rabbit were compared by analysis Capillary Electrophoresis SingleStranded Conformation Polymorphism (CE-SSCP) profiles of 16S rRNA genes. Ruminal and
fæcal contents were sampled in five cows for three weeks. Hard and soft faeces were
collected in 14 rabbits for three weeks and cæcal contents were sampled in the third week.
The archaeal community differed according to the host species and to the location within the
digestive tract. In both species, the archaeal community was stable over weeks and varied
very little between individual animals. The similarity of the archaeal community between
cæcal content and the soft faeces permitted to use the latter as a representative indicator.
Conclusions: The archaeal community varied between herbivorous mammals and within their
digestive tract but was stable over three weeks and presented few inter-individuals variations.
Significance and Impact of the Study: Even if archaeal communities occurring between
herbivores and within their digestive tracts were different, they seemed to present some
common characteristics: a relative stability over time and between individuals.
Keywords: Archaea, community structure, cow rumen, faeces, rabbit cæcum, richness index
195
Etude expérimentale – Chapitre 2
196
Etude expérimentale – Chapitre 2
2
In the digestive tract, methanogens belong exclusively to the domain of Archaea
(Jones et al., 1987). They have a key function in the final stage of organic matter decay by
microorganisms in the digestive ecosystem. The degradation by microorganisms releases
hydrogen and carbon dioxide. The methanogens use this hydrogen to reduce the carbon
dioxide to methane. By removing hydrogen, methanogens help to improve the efficiency of
fermentation and the reductive capacity of the ecosystem (Lange et al., 2004). Animal
producers of methane are found among both invertebrates and vertebrates, herbivores and
carnivores, living in various environments, indicating that the presence of Archaea is
independent of the climate, diet, and complexity of the digestive system (Lange et al., 2004).
The methane emitted by animals contributes to global warming (Moss, 1993) and to the loss
of 6% to 8% of the ingested energy in intensively-bred animals (Boadi et al., 2004; Johnson
& Johnson, 1995). Consequently, the archaeal community has been studied in various species
and especially in ruminants by quantification of methane emission (Hackstein & van Alen,
1996), cultural methods (Miller & Wolin, 1986; Miller et al., 1986) and molecular tools
(Skillman et al., 2006; Tajima et al., 2001b; Tatsuoka et al., 2007; Tokura et al., 1999). These
studies have demonstrated the predominance in the animal digestive tract of
Methanobrevibacter sp. associated with few Methanomicrobium sp., Methanobacterium sp.
and Methanosarcina sp. (Garcia et al., 2000; Jarvis et al., 2000). In herbivores, Archaea are
principally present in the fermentative compartments because of i) the anaerobic conditions
since oxygen is highly toxic to Archaea (Petersen et al., 1998), ii) the intense fermentation
activity that provides hydrogen and carbon dioxide and iii) the slow transit which allows
intense fermentation (Mackie, 2002; Stevens & Hume, 1998). Fermentative compartments can
be positioned either at the beginning or at the end of the digestive tract. Proximal fermentors
are observed for example in ruminants whereas distal fermentors are observed in the majority
of other herbivores. The rabbit possesses an extensively developed cæcum as a distal
fermentative compartment, and is a cæcotrophic animal. During production of hard faeces, the
largest particles of the cæcal content are sorted and excreted as hard faeces, corresponding to
the true faeces. However during the production of soft faeces, the sorting activity decreases
and a small part of the cæcal content is excreted as soft faeces (Ruckebusch & Hörnicke,
1977). Physicochemical characteristics (Carabaño et al., 1988) and the bacterial community
(Michelland et al., 2008) of the cæcal content have been reported to be similar to those of soft
faeces .
197
Etude expérimentale – Chapitre 2
We hypothesize that the archeal community will differ according to the digestive
strategies of two herbivorous mammals: the cow and the rabbit. Thus the aim of this study
was to compare the archaeal community in the fermentative compartment and faeces of the
cow and the rabbit, which differ in their digestive physiology. To learn more about the archeal
community dynamics (temporal and spatial variation) and about variation between individual
animals, we studied this community using CE-SSCP of the V3 region of the archaeal 16S
rRNA gene fragment.
4
4
5
Five rumen-fistulated dry adult Prim Holstein cows were fed twice daily at 0800 h and
1700 h with a maintenance diet of 2 kg of hay, 2 kg of barley straw, 1 kg of ground maize and
0.08 kg of mineral supplement. They were adapted to the diet for 21 days before sampling.
Samples from the ventral rumen and faeces were collected three hours after the morning meal
once a week for three consecutive weeks. Ventral ruminal samples were filtered through a 1.6
mm sieve. Fourteen New Zealand x Californian adult rabbits (84 days old) were maintained in
individual cages in a controlled environment. They were fed ad-libitum a standard diet (18 %
crude protein; 2.0 % crude fat; 14.2 % crude fiber; 19.4 % starch; 16.5% ADF) containing no
antibiotics or coccidiostats. They were adapted to the diet for two weeks before sampling.
Soft and hard faeces were collected once a week for three consecutive weeks. Soft faeces
were collected by fitting a collar on the day of sampling, as done by Gidenne and Lapanouse
(2000). To avoid stress, the rabbits were adapted to the collar for 14 days before the
experiment. Cæcal contents were collected surgically on the third week as described by
Bellier et al. (1995). Cows and rabbits were cared for in accordance with the guidelines for
animal research of the French Ministry of Agriculture (Anonymous, 27 avril 1988).
42
5
K
Total DNA was extracted and purified using QIAamp® DNA Stool Mini kit (Qiagen
Ltd, West Sussex, England) directly from about 0.2 g of sample. The V3 region of the 16S
rRNA genes was amplified by semi-nested PCR. The primer sets Archf364/Archr1386 and
Archf364/5’-6FAM-labeled w34 were used for the first PCR at an annealing temperature of
58°C and for the second PCR at and annealing temperature of 50°C respectively (Duthoit et
al., 2003; Skillman et al., 2004). First PCR with Archf364 and Archr1386 primers ensured
198
Etude expérimentale – Chapitre 2
highly specific amplification of a 1022 bp fragment of archaeal 16S rRNA genes. The second
PCR with Archf354 and universal 5’-6FAM-labeled w34 primers maintained the specificity
but provided a small 179 bp fragment in the V3 region of archaeal 16S rRNA genes necessary
to be efficiently separated by CE-SSCP. PCR was carried out in a 50 µL reaction mixture
containing 5 µL 10× buffer, 0.2 µM of each primer, 200 µM of each dNTP, 0.25 U Pfu Ultra
II Fusion HS DNA polymerase (Stratagene), 25 µg bovine serum albumin (Biolabs) and 1 µ L
of 200 times diluted DNA extract for the first PCR or 1 µL of DNA amplicons for the second
PCR. The temperature program consisted of 2 min at 94°C, 35 cycles with 30 s at 94°C, 30s
at annealing temperature, 30s at 72°C followed by a final extension at 72°C for 10 min. PCR
products were checked for appropriate size by 1% agarose gel electrophoresis. The CE-SSCP
mix contained 1 µL of PCR product, 7.8 µL of deionised formamid (Genescan, Applied
Biosystem) and 0.2 µL of the internal standard labelled with 6-carboxy-X-rhodamine (ROX,
Applied Biosystems-HD400). Mixes were denatured at 95°C for 5 min and placed on ice
before loading. CE-SSCP was performed on an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer using a 36
cm length capillary and a 7.2% non-denaturing polymer consisting of 80% CAP polymer
(Applied Biosystems), 10% glycerol and 10% 10xTBE Buffer (Applied Biosystems).
Electrophoresis was performed at 25°C for 3500 s at 15 KV.
44
CE-SSCP profile processing and statistical analysis were computed with the program
StatFingerprints version 1.2 (Michelland et al., 2009b) working under R version 2.8.0 (R
development Core Team, 2008). CE-SSCP profiles of the archaeal community were spread
out in about 2000 scans. CE-SSCP profile processing required five successive steps i)
alignment of the CE-SSCP profiles together using their internal standards, ii) definition of a
common baseline between CE-SSCP profiles, iii) normalization to one of the total area under
each CE-SSCP profile, iv) detection of peaks with an area above 2% of the total area, and v)
transformation
into
presence/absence profiles.
Alignment,
baseline definition
and
normalization guarantee reliable comparison between CE-SSCP profiles. The 2% threshold
allows peaks considered as noise to be deleted. Transforming CE-SSCP profiles into
presence/absence profiles avoids the disturbances of the quantitative information due to biases
of the semi-nested PCR. In all, 128 CE-SSCP profiles were generated by CE-SSCP. Due to
the poor quality of the signal in some samples, we decided to omit 15 of the CE-SSCP
profiles from the statistical analysis of, i.e. seven, six, one and one samples coming from
rabbit hard faeces, rabbit soft faeces, cow rumen and cow faeces respectively.
199
Etude expérimentale – Chapitre 2
48
As soft faeces represent excreted cæcal content (Ruckebusch & Hörnicke, 1977), the
similarity between archaeal communities (richness index and structure) in soft faeces and
cæcal content was statistically tested. Indeed, the sampling of cæcal content using surgery is
difficult and disturbs the microbial community (Michelland et al., 2008).
Richness index was estimated by counting the number of detected peaks in each CESSCP profile. Firstly, the richness index was compared between soft faeces and cæcal content
to test whether the soft faeces were representative of cæcal content. For this purpose, analysis
of variance (ANOVA) was performed on the richness index of cæcal content and soft faeces
collected during the third week. Next, after having verified the similarity of the richness index
between cæcal content and soft faeces, the richness index was analyzed using analysis of
variance for all data except that for cæcal content. The model included the host species (cow
vs rabbit), the sample type (two levels: fermentative compartment i.e. cow rumen and rabbit
soft faeces, and faeces i.e. cow faeces and rabbit hard faeces), the week of sampling (three
levels), and their interactions as main effects. As the interaction between host species and
sample type was significant, data were finally analyzed to study first the host species’ effect
and then, within each host species, the sample type, sampling week and host individual animal
effects.
In the present paper, the study of the structure of the archaeal community refers to the
fine analysis of the presence / absence of peaks throughout the profiles. The proximity
between each pair of CE-SSCP profiles was achieved by calculating the Dice-Sørensen
similarity coefficient: Q =
2( n i ∩ n j )
ni + n j
, where ni and nj are the number of scans present
respectively in the ith and jth CE-SSCP profiles (Dice, 1945; Sørensen, 1948). To explore
these proximities, non-metric MultiDimensional Scaling (nMDS) was performed using 10000
random starts (Clarke, 1993). A two-dimensional display was produced by nMDS where each
CE-SSCP profile was represented by a single point. The degree to which the plot matched the
underlying proximities between CE-SSCP profiles was assessed by using the Kruskal stress.
A Kruskal stress value below 0.2 represents a reliable ordination (Clarke, 1993). Analysis of
similarity (ANOSIM) was performed on the proximities between CE-SSCP profiles using
10000 Monte Carlo permutations. For the ANOSIM analysis, a first step compared the
similarity of the soft faeces and cæcal content. As the archaeal communities of these two
sample types were not different, a second step was applied with the soft faeces used to study
200
Etude expérimentale – Chapitre 2
the fermentative compartment of the rabbit. Global ANOSIM was performed to test the
effects of host species, sample type, sampling week and individual on the structure of the
archaeal community. Pairwise ANOSIM was used as a post hoc test to determine which levels
within fixed effects significantly differed from each other. The factor tested was considered to
be significant when P<0.05. The ANOSIM-R value indicated the extent to which the groups
differed (ANOSIM-R > 0.75: well separated groups; 0.50< ANOSIM-R < 0.75: separated but
overlapping groups; 0.25 < ANOSIM-R < 0.50: separated but strongly overlapping groups;
0.25 < ANOSIM-R: barely separated groups; Ramette, 2007). An iterative Fisher's exact test
on the 2000 scans of the CE-SSCP profiles identified the scans which differed between the
two distinct communities studied.
8
8
;
Neither the richness index (9.7 ± 2.5, 10.1 ± 3.1 for the cæcum and the soft faeces
respectively; NS) nor the structure of the archaeal community (ANOSIM-R= 0.03, P=NS)
differed between the cæcal content and the soft faeces. Consequently, soft faeces were used in
this study as a reliable indicator of the archaeal community of the rabbit cæcum.
Fermentative compartment
True fæces
14
a
Richness index
12
b
b
b
10
8
6
4
2
0
Rumen Fæces Soft Hard
fæces fæces
Cow
Rabbit
Figure 36. Richness index of the archaeal community according to fermentative compartment
and faeces of cow and rabbit.
Mean values with the same letter were not significantly different at p=0.05.
201
Etude expérimentale – Chapitre 2
82
The richness index of the archaeal community of the digestive fermentative
compartment was higher in cows than in rabbits (13.1 ± 2.6, 9.7 ± 2.5 for cows and rabbits
respectively; P<0.05; Figure 36). Also, the structure of the archaeal communities in the
fermentative compartment differed between the cow and the rabbit (ANOSIM-R=0.53;
P<0.001; Tableau 19 and Figure 37). Several peaks, representing 18% of the scans,
distributed throughout the profiles, differed significantly between the fermentative
compartments of both host species (Figure 38).
Concerning faeces, the richness index of the archaeal community did not differ
between the two species (9.8 ± 2.7, 10.2 ± 2.4, respectively for the cow and the rabbit; Figure
36). However the structure of the archaeal communities differed between the faeces of the two
species (ANOSIM-R=0.72; P<0.001; Tableau 19 and Figure 37). The structures of the
communities were different for 20% of the scans (Figure 38).
202
Etude expérimentale – Chapitre 2
Tableau 19. Effect of host species, sample type and sampling week on the structure of the
archaeal community
CE-SSCP profile groups
ANOSIM-R
P
0.53
<0.001
0.72
<0.001
Sample type: rumen (n=14) vs faeces (n=14)
0.37
<0.001
Sampling week (n=28)
0.05
NS
Individual cow (n=28)
0.02
NS
Sample type: Soft faeces (n=36) vs hard faeces (n=35)
0.52
<0.001
Sampling week (n =71)
-0.01
NS
Individual rabbit (n=71)
0.18
<0.05
Host species comparison
Fermentative compartment: cow rumen (n=14) vs rabbit
soft faeces (n=36)
True faeces: cow faeces (n=14) vs rabbit hard faeces
(n=35)
Cow
Rabbit
NS: not significantly different (p> 0.05). n: number of CE-SSCP profiles included in the analysis.
84
F
The richness index of the archaeal community in the rumen was higher than that of the
faeces (P<0.01; Figure 36). The structure of the archaeal communities differed slightly
between the rumen and the faeces (ANOSIM-R=0.37, P<0.001; Tableau 19 and Figure 37).
This difference corresponded to 7 % of the scans clustered within the CE-SSCP profile
(Figure 38). Both structure and richness index of the archaeal communities in the rumen and
in the faeces of the cow were similar over three consecutive weeks and are similar between
individual animals (Tableau 19).
203
Etude expérimentale – Chapitre 2
Rumen
Fæces
Soft fæces
Hard fæces
Figure 37. Two-dimensional nMDS plot of cow and rabbit CE-SSCP profiles of the archaeal
community.
The stress of the nMDS is 0.18.
88
Richness index was not significantly different between soft faeces, representative of
the rabbit fermentative compartment, and hard faeces (Figure 36). However the structure of
the archaeal community of the soft faeces differed from that of the hard faeces (ANOSIM
R=0.52, P<0.001; Tableau 19 and Figure 37). The differences occurred for 20% of the scans,
scattered along the CE-SSCP profile (Figure 38). The structure and the richness index of the
archaeal communities in soft and hard faeces did not differ between the three weeks of the
experiment (Tableau 19) but differed between individuals (P<0.05 for richness index;
ANOSIM-R=0.18, P<0.05 for structure; Tableau 19). However, this inter-individual variation
was only due to one rabbit. Hence, if CE-SSCP profiles of this rabbit were to be omitted from
the statistical analysis, both the structure and the richness index of the archaeal community
would not differ between individuals (data not shown).
204
Etude expérimentale – Chapitre 2
Fermentative
compartment
Between (rumen vs sof t
f æces)
hosts
18%
A
20%
B
In the cow:
rumen vs
f æces
7%
C
In the rabbit:
sof t vs hard
f æces
20%
D
True f æces
(cow f æces vs
hard fæces)
Within
host
0
500
1000
1500
2000
Localisation of significant differences occurring along the CE-SSCP prof ile
Figure 38. Localization archaeal in digestive tract of significant differences occurring along the
CE-SSCP profile between the fermentative compartment (A) and faeces (B) of the two host
species, between the rumen and the faeces of the cow (C), and between the soft and the hard
faeces of the rabbit (D).
Differences at p<0.05 are indicated by black vertical bars. The percentage of scan significantly
different is indicated at the right.
:
The CE-SSCP used in this study is a high throughput fingerprint method which has
been successfully applied to investigate the ecology of microorganisms in many different
environments (Brinkmann et al., 2008; Hori et al., 2005; Zinger et al., 2008). In this study,
the archaeal communities in the digestive tract (fermentative compartment and faeces) of two
herbivorous species, the cow and the rabbit, were compared by analysis of 16S rRNA gene
fragments using CE-SSCP. The archaeal communities were considered different if at least one
of the criteria used was different: either richness index or community structure.
Our study demonstrated that the structure and the richness index of the archaeal
community were similar in the cæcum and in the soft faeces. With the same method (CESSCP) and data analysis used in this study, Michelland et al. (2008) found similar bacterial
communities for cæcal content and soft faeces. This result was in accordance with the
digestive physiology of the rabbit since soft faeces are in fact cæcal content covered by a
mucus envelope secreted in the colon (De Blas & Wiseman, 1998) resulting in a similar
physico-chemical composition (Carabaño et al., 1988; Fraga et al., 1991). Consequently, in
the present study to study the archaeal community, the soft faeces were used as an alternative
205
Etude expérimentale – Chapitre 2
to the cæcal content which is difficult to access without disturbing the digestive physiology of
the host. To our knowledge, this study is the first accurate investigation of the archaeal
community in the rabbit cæcum and faeces with molecular technologies.
Within the rabbit digestive tract, our results showed that the structure of archaeal
communities differed between the soft faeces and the true faeces. To our knowledge, the
comparison of the archaeal community or of the methane emission between cæcum and faeces
has never been investigated in the rabbit. However, this result could be explained by the
digestive physiology of the rabbit. Indeed, hard faeces correspond to the bigger particles of
the cæcal content which are sorted and then excreted whereas soft faeces correspond to the
whole cæcal content covered by a mucus layer (Björnhag, 1972; Pickard & Stevens, 1972).
As a consequence, the chemical composition of the soft faeces is quite different from that of
hard faeces, with more proteins in soft faeces (300 and 170 g kg-1 dry matter respectively for
soft and hard faeces) and more fibrous particles in hard faeces (180 and 300 g kg-1 dry matter
respectively for soft and hard faeces; (Carabaño et al., 1988; Fraga et al., 1991). Such
differences in chemical composition of soft and hard faeces could explain why they contain
different archaeal communities. Moreover some authors demonstrated that the greater the
concentration of fibrous particles, the more methanogens were present in the community
(Miller, 1995; Minato et al., 1992; Morvan et al., 1996).
Within the cow’s digestive tract, our results showed different archaeal community
structures between the fermentative compartment (the rumen) and the faeces, coupled with a
larger number of species in the rumen than in the faeces. As far as we know, no comparison
of the archaeal community between faeces and rumen of the cow has ever been published. A
positive relation between the number of methanogens, of cellulolytic organisms and the fiber
proportion in the rumen content was observed in several animals (Miller, 1995; Minato et al.,
1992; Morvan et al., 1996). From 50 to 80 % of fiber lysis occurred in the rumen and thus the
fiber content of faeces is lower than in rumen (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008c). These
two findings may explain the smaller archaeal community development in the faeces than in
the rumen observed in our study.
The structure of the archaeal community differed in the fermentative compartment of
the two herbivores, and the number of molecular species (richness index) was higher in the
cow rumen than in the rabbit cæcum. Conversely, Bennegadi et al. (2003) demonstrated that
the archaeal community represents 12.1% of the total RNA in 70-day-old rabbits, while it
does not exceed 2% in the cow (Lin et al., 1997). This could be explained by the primers
206
Etude expérimentale – Chapitre 2
used. Indeed, the archaeal diversity revealed from 16S rRNA gene clone libraries sequencing
has been shown to depend on the choice of the archaeal-specific primers (Skillman et al.,
2006; Tajima et al., 2001b). In this study, the primers Arch f364/Arch r1386 were used
because i) they are more specific and reliable than other developed primers, ii) they accurately
represent the archaeal species inhabiting the mammal digestive tracts (Skillman et al., 2006).
However, the 1022 bp amplicons were too long to be efficiently discriminated by CE-SSCP.
Thus, the PCR-products obtained were re-amplified with primers Archf364/universal 5’6FAM-labeled w34 (Duthoit et al., 2003) to lead to both specific and short fragments of 179
bp. The present method was highly specific to the Archaea domain and provided a huge
polymorphism of the fragment conformations needed for CE-SSCP. All these results
suggested that in the rabbit cæcum the richness of the archaeal community was less than in
the cow rumen. When comparing the archaeal community in the true faeces of both species,
we observed different structures but a similar number of species. A previous study using
cultural methods demonstrated the presence of hundreds of times more methanogens in the
faeces of cattle compared to that of the rabbit (Sorlini et al., 1988). These results were
strikingly different and need to be elucidated using molecular quantitative methods.
Our results demonstrated no inter-individual variability of the archaeal community
between five cows and 13 rabbits. However, in vivo and in vitro studies of methane emission
of cæcal content in adult rabbits have shown that only some individuals exhibit a high
methane production (Belenguer et al., 2008; Marounek et al., 1999; Piattoni et al., 1996). In
the human colon, a great variability of the methanogen quantity and methane production has
been reported between individuals (Doré et al., 1995; El Oufir et al., 1996; Pochart et al.,
1993), but this was more related to environmental than to genetic effects (Florin et al., 2000).
In the same way, in our study, the animals shared the same environment, the same breeding,
the same cage for rabbits and the same cattle shed for cows. Such a situation may induce
contamination with digestive flora and hence a similar archaeal community
In accordance with current opinion (Florin et al., 2000), no variation in the archaeal
community during the three weeks of the experiment was recorded in either host species. This
suggests a relative stability of communities from week to week. In different species, great
variability in the quantity of Archaea was observed during the early days after birth but not
after the ecosystem reached maturity. Indeed, the density of the archaeal population remained
stable after about one month in the lamb rumen (Morvan et al., 1994; Skillman et al., 2004).
In the rabbit, the amount of Archaea varies until 70 days (Bennegadi et al., 2003). However,
207
Etude expérimentale – Chapitre 2
no investigation was conducted after this age to study the stability of the archaeal community
in the mature cæcal ecosystem.
E
In conclusion, the present study demonstrates that the digestive tract of the cow and
the rabbit harbor two different archaeal communities. These communities were stable from
week to week and presented very little or no inter-animal variation. In both animals,
comparison between fermentative compartments and faeces showed that the archaeal
community varied along the digestive tract.
G
I
F
The authors are grateful to technical assistance in the lab and in the breeding center.
The work of the staff at the Centre de Ressources, Génotypage et Séquencage of Toulouse is
gratefully acknowledged.
208
Etude expérimentale – Chapitre 2
H
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213
Etude expérimentale – Chapitre 2
214
Etude expérimentale – Chapitre 3
.9
9
1
=
Dans cette dernière partie, nous avons étudié la réponse des fermenteurs digestifs à
une perturbation d’origine nutritionnelle maintenue pendant plusieurs semaines. Pour cela
nous avons choisi d’augmenter le ratio amidon/fibres de le ration distribuée à l’hôte car il a
été montré précédemment qu’une réduction de la teneur en fibres dans l’alimentation
engendre des troubles sanitaires chez le lapin (augmentation de la mortalité suite à des
troubles digestifs) et chez la vache (acidose). L’objectif de cette partie est de caractériser la
réponse de la communauté bactérienne, son ampleur et sa mise en place, à ce type de
perturbation. Outre un intérêt fondamental sur les capacités de réponse des écosystèmes
microbiens, cette partie a pour but d’enrichir les connaissances sur les possibilités de contrôle
du microbiote par l’alimentation afin d’améliorer les performances (efficacité digestive) et de
diminuer les problèmes sanitaires dans les filières bovins lait et cunicole (santé digestive).
Notre objectif étant de réaliser une approche comparée entre la vache et le lapin, nous
nous sommes attaché à décliner ces essais dans ces deux espèces de la façon la plus proche
possible et avons ensuite traité les échantillons, exploité et analysé les données de façon
contemporaine et similaire. Néanmoins, cette volonté a été confrontée aux différences
physiologiques entre les deux espèces. En effet, les modèles de perturbation nutritionnelle
appliqués dans les deux espèces sont de même nature (augmentation du ratio amidon/fibres)
mais ont été réfléchis pour avoir un sens vis-à-vis des besoins nutritionnels et de la
physiologie des deux espèces étudiées.
215
Etude expérimentale – Chapitre 3
216
Etude expérimentale – Chapitre 3
/
0
1
R.J., Michelland, V. Monteils, S. Combes, L. Cauquil, T. Gidenne, L. Fortun-Lamothe
Mots clés : perturbation nutritionnelle, dynamique, microbiote, vache, fraction ruminale,
qPCR, CE-SSCP
Titre abrégé : Perturbation nutritionnelle et populations bactériennes du rumen
Résumé
Le but de ce travail était d’étudier la réponse de la communauté bactérienne du rumen
de la vache en réponse une perturbation nutritionnelle induite par une augmentation du ratio
amidon/fibres. Quatre vaches ont été nourries avec un régime riche en fibres durant 21 jours
puis brusquement nourries avec un régime alimentaire riche en amidon durant 33 jours. Les
fractions liquide et solide du contenu ruminal ont été collectées régulièrement avant (n=13) et
après la perturbation (n=23). Les communautés bactériennes ont été caractérisées par CESSCP tandis que les populations de Bactéries totales, de Bacteroides Prevotella et de
Firmicutes ont été quantifiées par qPCR. Les principaux paramètres physico-chimiques ont
été mesurés dans la fraction liquide du rumen. Dans les deux fractions, la perturbation
nutritionnelle a réduit de 6% l’indice de diversité des communautés bactériennes (P<0.001)
mais n’a pas affecté leur structure. De plus, le nombre de copies de gène des Bactéries, des
Firmicutes et des Bacteroides Prevotella diminue légèrement (de 1 à 2%; P<0.01). Après la
perturbation, l’environnement ruminal est devenu plus acide (-0.5 unité, P<0.001), moins
réducteur (+54 mV, P<0.001) et présente une augmentation de la concentration en AGV
totaux (+26%, P<0.001) et une réduction de la concentration en NH3-N (- 48%, P<0.001).
Avant la perturbation, les communautés bactériennes fluctuent de façon sporadique atour d’un
état constant. Après la perturbation, les communautés bactériennes continuent à fluctuer mais
autour d’un état différent. La fraction solide du rumen a un indice de diversité plus élevé
(+17%, P<0.001) et une quantité des divisions bactériennes étudiées plus importante (de 4 à
7%, P<0.001) que la fraction liquide. Les réponses à la perturbation nutritionnelle sont
similaires entre les deux fractions.
217
Etude expérimentale – Chapitre 3
218
Etude expérimentale – Chapitre 3
/
R.J., Michelland1,2,3, V. Monteils2,1,3, S. Combes1,2,3, L. Cauquil1,2,3, T. Gidenne1,2,3, L. FortunLamothe1,2,3
1
INRA, UMR 1289 TANDEM, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
2
Université de Toulouse, INPT-ENSAT,
UMR 1289 TANDEM, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
3
ENVT, UMR 1289 TANDEM,
F-31076 Toulouse, France.
Running title : Nutritional disturbance of the rumen bacteria
Corresponding author. Name : Valérie Monteils. Mailing address: Ecole Nationale Supérieure
Agronomique de Toulouse, UMR 1289, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme,
BP
32607,
F-31326
Castanet
Tolosan
Cedex,
France.
E-mail:
valerie.monteils@ensat.fr. Phone: 33 (5) 62 19 39 09. Fax: 33 (5) 62 19 39 01.
219
Etude expérimentale – Chapitre 3
220
Etude expérimentale – Chapitre 3
This work aimed to study the response of the bacterial community in the bovine rumen
to a nutritional disturbance induced by an increase of the dietary starch/fiber ratio. Four cows
were fed a high-fiber diet during 21 days and suddenly switched into a high-starch diet during
33 days. Liquid and solid fractions of the rumen contents were collected regularly before
(n=13) and during the challenge (n=23). The bacterial communities were characterized by
CE-SSCP and the total Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes were quantified by
qPCR. In addition, main physico-chemical parameters were measured in the liquid fraction of
the rumen. In both fractions, the nutritional disturbance reduced by 6% the diversity index of
the bacterial community (P<0.001) but did not affect its structure. Furthermore, the number of
gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella decreased slightly (from
1 to 2%; P<0.01). After the disturbance, the ruminal environment became more acid (-0.5
unit, P<0.001), less reductive (+54 mV, P<0.001) with an increase of total VFAs
concentration (+26%, P<0.001) and a decrease of NH3-N concentration (- 48%, P<0.001).
The bacterial community reached different states before and after the disturbance but
presented sporadic fluctuations without any clear trends around these states. The solid fraction
of the rumen had a higher diversity index (+17%, P<0.001) and higher quantities of bacterial
divisions (from 4 to 7%, P<0.001) than the liquid fraction. The responses to the nutritional
disturbance were similar for the both fractions.
Keywords: nutritional disturbance, dynamic, microbiota, cow, ruminal fraction, qPCR, CESSCP
221
Etude expérimentale – Chapitre 3
222
Etude expérimentale – Chapitre 3
2
Rumen is composed of a complex symbiotic microbiota which is in charge of biomass
degradation at relatively rapid rate under anaerobic conditions (Flint, 1997). The rumen
contains a majority of Bacteria (1010-12 cell ml-1), and also Protozoa (108-9 cell ml-1), and
Archaea (107-9 cell ml-1 ; Klieve & Swain, 1993; Mackie et al., 1997). Among bacteria, the
predominant divisions are the Firmicutes and the Bacteroides associated with few
Spirochaetes and Proteobacteria (Tajima et al., 1999) In the rumen, the Bacteria were spread
out in three main micro-niches: i) free-living in the rumen fluid, ii) associated with feed
particles and iii) associated with rumen epithelium (Czerkawski & Cheng, 1988; McAllister et
al., 1994; Miron et al., 2001). Specific bacterial communities have been reported to inhabit
each micro-niche (Cho et al., 2006; Larue et al., 2005; Sadet et al., 2007; Tajima et al., 1999).
Indeed, Cho et al (2006) using clone library sequencing reported 30%, 75.7%, 5.6% of
Firmicutes and 67.5%, 10.8% and 94.4% of Cytophaga Bacteroides Prevotella respectively
among bacteria associated to fluid fraction, feed particles fraction and rumen epithelium. The
composition of diet offered to the cow (high-fiber vs high-starch diets) have been reported to
change the bacterial communities of both the rumen fluid and feed particles fraction
(Kocherginskaya et al., 2001; Koike et al., 2003a; Larue et al., 2005; Tajima et al., 2001a;
Tajima et al., 1999; Whitford et al., 1998). In contrary, the bacterial community associated
with epithelium did not differ according to the diet (Sadet et al., 2007). The adaptation of the
bacterial community to a modification of the nutrient supply has been studied in several
works using cultural methods (Goad et al., 1998; Hungate, 1968; Nocek, 1997; Owens et al.,
1998; Slyter, 1976) and one clone library sequencing (Tajima et al., 2000). Tajima et al.
demonstrated that 3 days after a permanent dietary switch, the rumen contained six-times
more Bacteroides Prevotella and a quarter less of Firmicutes than just before the disturbance.
The concentrations of Bacteroides Prevotella and Firmicutes reached approximately the
initial level 28 days after disturbance. This study demonstrated the adaptability of the
bacterial community to nutrient supply but also highlighted lack of knowledge concerning
dynamic of community after disturbance using closer interval of sampling and both
qualitative and quantitative information of the whole community.
Consequently, this study aims to evaluate the response of the ruminal ecosystem to a
nutritional disturbance consisting in a sudden and permanent switch from a high-fiber diet to a
high-starch diet. The bacterial community was characterized, in both liquid and solid fraction,
by two complementary molecular approaches: the CE-SSCP to analyse the bacterial structure
223
Etude expérimentale – Chapitre 3
and estimate the bacterial diversity, and the quantitative PCR to quantify total Bacteria and
the main Bacteria divisions i.e. Firmicutes and Bacteroides Prevotella. Simultaneously,
several environmental parameters were measured to evaluate the impact of the disturbance on
the bacteria environment. The data obtained before and after disturbance permitted to study
the correlations between the bacterial community and its environment.
4
4
5
Four non-lactating Prim Holstein cows fistulated in the rumen were kept indoors in
individual pens of the experimental unit of UMR 1289 TANDEM (Poucharramet, France)
during the 56 days of the experiment. They were fed with 10.5 kg gross day-1 of a high-fiber
diet from the 1st to the 21st day of the experiment. The high-fiber diet consisted of 57% of hay
alfalfa, 24% of ground corn and 19% of wheat straw which resulted of 13.1% cellulose,
13.3% hemicellulose, 12.3% starch and 11.5% crude protein. Animals were adapted to the
high-fiber diet during 3 weeks before the experiment. The 22nd day of experiment, animals
were suddenly switched to a high-starch diet until the end of the trial. They were fed with 23
kg gross day-1 of the high-starch diet consisting on 87% corn silage, 9% ground corn and 4%
soybean meal. The high-starch diet was composed of 16.2% cellulose, 17.0% hemicellulose,
26.7% starch and 6.2% crude protein. During the whole experiment, the cows were fed twice
daily at 0900 h and 1700 h with free access to fresh water and a mineral salt mix. The cows
were cared for in accordance with the guidelines for animal research of the French Ministry of
Agriculture (Anonymous, 27 avril 1988).
42
K
All samplings and measurements were achieved in the ventral site of the rumen.
Samplings and measurements were performed 3 hours after morning meal (at 1200 h). Before
the nutritional disturbance, samplings and measurements were done the 1st, 3rd, 5th, 8th, 10th,
13th days and each day from the 15th to the 21st day. After the dietary switch, samplings and
measurements were done each day from the 22nd to the 36th day, and the 38th, 40th, 43rd, 45th,
47th, 50th, 52nd and 54th days of the experiment. For microbial analyses, approximately 250
mL of ruminal content was collected. To separate the liquid and solid fractions, a filtration
through a 250 µm sieve was done with pressure of 54N during 60 seconds. Samples of about
200 mg of the rumen fluid fraction (in the filtrate) and of the feed particle fraction (in the
224
Etude expérimentale – Chapitre 3
retentate) were collected. At all 288 samples were collected and stored at -20°C until
microbial analyses.
The pH and the redox potential were measured with the ex-vivo anaerobic method
developed by Marden et al. (2005). The redox potential data were corrected by adding the
potential of the reference hydrogen electrode, i.e. +199 mV (Marden et al., 2005; Nordstrom,
1977). Others environmental parameters were determined in the fluid fraction obtained after
the 250 µm-filtration of the ventral rumen content. For volatile fatty acids (VFA)
determination, 10 mL of liquid fraction were added to 1 mL of 2% HgCl2. Quantification of
VFA was performed by automated gas chromatography (5890 Series II with a flameionization detector, Hewlett-Packard, Avondale, PA) according to Playne (1985). For NH3-N
determination, 10 mL of liquid fraction were added to 100 µL of H2SO4. NH3-N concentration
was determined with a colorimetric method by a Continuous Flow Analyzer (SAN++, Skalar,
Norcross, Georgia,USA) as previously described by Krom (1980).
44
5
Total genomic DNA from about 200 mg of sample was extracted and purified with
QIAamp® DNA Stool Mini kit (Qiagen Ltd, West Sussex, England) according to the
manufacturer's instructions.
48
E
The V3 region of the 16S rRNA genes was used as a bacterial diversity marker using
the primers w49 and 5’-6FAM-labeled w34 (Delbès et al., 1998; Zumstein et al., 2000). PCR
assays were performed as previously described (Michelland et al., 2009c) using Isis DNA
Polymerase (Qbiogene, Irvine, California, USA). The capillary electrophoresis singlestranded conformation polymorphism (CE-SSCP) was performed on an ABI Prism 3100
Genetic (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) as previously described
(Michelland et al., 2009c).
225
Etude expérimentale – Chapitre 3
4:
CE-SSCP profiles were aligned, normalized and diversity index was estimated using
StatFingerprints program version 1.3 (Michelland et al., 2009b) running on R version 2.8.3 (R
development Core Team, 2008). Diversity index was estimated for each CE-SSCP profile
using – log10 ∑(ai)² with ai the relative area under the ith peak (Haegeman et al., 2008;
Rosenzweig, 1995).
The community structure of an ecosystem has been defined as a list of the species and
their relative abundance in the community (Begon et al., 1996). In the present paper, the study
of the structure of the bacterial communities refers to the fine analysis of the size of the
various peaks throughout the CE-SSCP profiles.
4E
The primers were designed or modified from literature using the software ARB
(Ludwig et al., 2004) and the 16SrDNA database SSURef_96_SILVA_04_10_08_opt.arb
generated by the SILVA project (Pruesse et al., 2007). The specificity of the primers was
evaluated by the calculation of the matching efficiency defined as the ratio of the number of
matching sequences to the total number of sequences in the target database (Yu et al., 2005).
As suggested by Smith and Osbone (2009), for the design of primers and probe, amplicons
size, melting temperature (Tm), percentage of G+C bases possibility of self complementarity
of the sequence were investigated using Primer express software (version 2.0, Applied
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA).
Assays were performed using the ABI Prism 7900HT sequence detection system
(Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) using optical grade 384-well plates in a
final volume of 10 µL. TaqMan qPCR technology was used for absolute quantification of
total Bacteria and Bacteroides Prevotella group. TaqMan reaction mixture contained 2.5 µL
of DNA template, the specific primer set at 200 µM each (Tableau 20) and 5 µL of TaqMan®
universal PCR master mix (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). SYBR
Green qPCR technology was used for absolute quantification of Firmicutes group. SYBR
Green assays reaction mixture contained 2.5 µL of DNA template, the specific primer set at
100 µM each (Tableau 20) and 5 µL of Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). The PCR program consisted of 10 min at 94°C,
followed by 40 cycles with 15 s at 94 °C, 1 min at 60 °C. A dissociation curve was added to
226
Etude expérimentale – Chapitre 3
SYBR Green assays to check the specificity of the amplification. At least four nonzero
standard concentrations were used in each assay.
Standard curves were generated by amplification of the serial ten-fold dilutions of
plasmid (from 104 to 109 copy number) containing the 16S rRNA gene sequence of
Ruminococcus albus (acc: EF445158; 1489 pb), Butyvibrio fibrisolvens (acc: EF445262; 1504
pb) and Prevotella bryantii (acc: EF445235; 1490 pb) for quantification of total Bacteria,
Firmicutes and Bacteroides Prevotella respectively. Plasmid concentrations were measured
using NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington,
Delaware, USA). The copy number for each reaction was calculated from the standard curves.
16S rRNA-gene-targeted group primers set to Firmicutes and Bacteroides developed
or adapted in our study (Layton et al. 2006 and Guo et al. 2008b) were highly specific.
Indeed, primers and probe for Bacteroides Prevotella quantification with zero mismatch
allowance matched with almost 92% of the targeted sequences in the database, 0% of notBacteroides and not-Prevotella Bacteria (Tableau 20). Primers for Firmicutes quantification
with zero mismatch allowance matched with almost 78% of the targeted sequences in the
database and only 4% of not-Firmicutes Bacteria.
227
Etude expérimentale – Chapitre 3
Tableau 20. PCR primers and probes used for qPCR assays
Target group
qPCR assay
Primer /
Probe
sequence (5’ → 3’)
E. Coli
numbering
Size
(bp)
Tm
(°C)
Matching efficiency (%)
Target
groupα
Total Bacteria
Bact1369F
Bact1492R
TM1389F
Forward
Reverse
Probe
Bacteroides Prevotella
296F21
Forward
References
0M
2M
Upper group
minus target
groupβ
0M
2M
CGGTGAATACGTTCYCGG
TACGGCTACCTTGTTACGACTT
6FAM-CTTGTACACACCGCCCGTCMGB
1369-1386
1492-1513
1389-1407
142
59.2
54.7
58.6
80
ND
58
92
ND
77
0
ND
0
1
ND
34
GAGAGGAAGGTCCCCCACATT
296-316
110
60.1
92
99
0
0
385R21
Reverse
CACGCTACTTGGCTGGTTCAG
385-405
59.5
98
100
0
3
375R29
Probe
6FAM-CCATTGACCAATATT
CCTCACTGCTGCCT-TAMRA
375-404
69
98
100
5
27
Firmicutes
Firm1048F20
Forward
ACAGGTGGTGCATGGTTGTC
1048-1066
57.9
90
100
4
70
Firm1196R23
Reverse
CATAAGGGGCATGATGATTTGAC
1196-1217
59.2
78
99
4
18
170
(Suzuki et al., 2000)
(Firmesse et al., 2007)
(Suzuki et al., 2000)
(Layton et al., 2006) modified in this
study
(Layton et al., 2006) modified in this
study
(Layton et al., 2006)
(Guo et al., 2008a) modified in this
study
This study
We used the SILVA database SSURef_96_SILVA_04_10_08_opt.arb (Pruesse et al., 2007) with an align quality up to 75% and a pintail up to 50%. The
matching efficiency of primers and probe was calculated as the ratio of the number of matching sequences to the total number of sequences in the target
database. α: the target group matching efficiency were calculated with specific databases for total Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes qPCR
assays and contained respectively 249635, 14359 and 89610 sequences. β: the upper group minus target group matching efficiency corresponded to total
Eucarya plus Archaea, total Bacteria minus Bacteroides Prevotella and total Bacteria minus Firmicutes, respectively for the total Bacteria, Bacteroides
Prevotella and Firmicutes qPCR assays. The upper group minus target group databases contained 36996, 235276 and 160025 sequences, respectively for the
total Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes qPCR assays. Abbreviations: Tm, melting temperature according to Primer express software (version
2.0, Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA); M, mismatch; ND, not determined.
228
Etude expérimentale – Chapitre 3
4G
All statistical analyses were carried out using StatFingerprints version 1.3 (Michelland
et al., 2009b) running on R version 2.8.3 (R development Core Team, 2008).
To test the effect of the nutritional disturbance on the environmental parameters (pH,
redox potential, total VFA, acetic acid, butyric acid, propionic acid and NH3-N), analyses of
variance (ANOVA) were used with the period as fixed effect (2 levels : before and after the
nutritional disturbance). The evolution of the environmental parameters were tested in two
subsequent analyses using ANOVA and Tukey's honest significant differences (HSD) posthoc tests with sampling days as fixed effect. The first analysis concerned the data obtained
before the disturbance (13 levels) and the second one, the data obtained after the disturbance
(23 levels).
To test the effect of the nutritional disturbance on the qPCR data and the diversity
index, ANOVA were used with the period (two levels: before and after disturbance), the
ruminal fraction (2 levels: liquid or solid) and their interaction as fixed effects. The dynamic
of the community were tested in two subsequent analyses (before and after disturbance data
sets) using ANOVA and Tukey's HSD with sampling days, ruminal fraction and their
interaction as fixed effects.
To test the effect of the nutritional disturbance in both ruminal fractions on the
structure of the bacterial community (whole CE-SSCP profiles data), a centered and scaled
principal components analysis (PCA) and a fifty-fifty multivariate ANOVA (FF-MANOVA)
with 10000 rotations (Langsrud, 2002; Langsrud, 2005) were used. The FF-MANOVA was
performed using period (before or after nutritional disturbance), the ruminal fraction (liquid or
solid) and their interaction as fixed effects. When effect was significant, an iterative MannWhitney test was applied on each scan of the CE-SSCP profiles to identify the scan position
which differed along the CE-SSCP profile. The dynamic of the bacterial community structure
before and after the nutritional disturbance were tested in two subsequent analyses using FFMANOVA with sampling days, ruminal fraction and their interaction as fixed effects.
The correlations between the environmental parameters, the diversity index and the
number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella in the fluid
fraction were calculated using a centered and scaled PCA. The correlation between the
structure of the bacterial community in the fluid fraction (whole CE-SSCP profiles data) and
the environmental parameters were investigated separately before and after nutritional
229
Etude expérimentale – Chapitre 3
disturbance using redundancy analysis (RDA) with 10000 Monte Carlo permutations
(Legendre & Legendre, 1998). Prior to the RDA, the environmental parameters included in
the model were selected using a stepwise selection. As environmental parameters were
expressed in different units, they were standardized to zero mean and unit variance prior to
RDA.
8
8
Tableau 21. Effects of the nutritional disturbance on the environmental parameters of the
rumen.
pH
Redox potential (mV)
NH3-N (mmol L-1)
Total VFAs (mmol L-1)
C2 (mmol L-1)
C3 (mmol L-1)
C4 (mmol L-1)
disturbance
before
after
6.67 ± 0.11
6.21 ± 0.18
-222 ± 17
-168 ± 38
142.0 ± 42.3
74.3 ± 35.8
77.0 ± 15.6
96.9 ± 13.6
54.3 ± 10.9
63.6 ± 9.1
12.5 ± 2.6
17.1 ± 3.4
7.0 ± 1.7
12.5 ± 2.1
significance
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
Abbreviations: C2, acetic acid; C3 propionic acid; C4 butyric acid. Mean ± standard deviation.
As expected, the diet composition modified the ruminal environment. The nutritional
disturbance induced a more acidic (-0.5 unit) and a less reductive environment (+54 mV;
P<0.001; Tableau 21). The fermentative pattern was also affected with a decrease of 48% of
the NH3-N concentration and an increase of 26% of the total VFAs concentration (P<0.001).
VFAs concentrations increased by 17%, 37% and 79% for acetic, propionic and butyric acids
concentrations, respectively (P<0.001).
Before the nutritional disturbance, the pH, the redox potential, the total VFAs, the
acetic acid and propionic acid proportions were stable over time (Figure 39). The NH3-N and
butyric acid concentrations varied over time but these overall changes were observed on nonconsecutive sampling days (P<0.05).
After the nutritional disturbance, the pH varied in time (P<0.01) with punctual and
sporadic fluctuations. The redox potential increased progressively during the entire postdisturbance period (from -239 mV to -114 mV from the 22nd day to the 52nd day; P<0.001).
The NH3-N evolved sporadically from the disturbance until the 32nd day (95 ± 27 mmol l-1;
P<0.001) and then remained stable at a lower level (57 ± 27 mmol l-1) until the end of the
230
Etude expérimentale – Chapitre 3
experiment. All VFAs (total VFAs, acetic, propionic and butyric acids) concentrations were
stable over time after the disturbance.
231
Etude expérimentale – Chapitre 3
pH
disturbance
6.8
6.6
6.4
6.2
6.0
5.8
1
5
10
15
20
Eh
(mV)
25
30
35
Time (days)
40
45
50
54
40
45
50
54
40
45
50
54
40
45
50
54
-100
-150
disturbance
-200
-250
1
5
10
15
NH3-N
mmol L-1
20
25
30
35
Time (days)
disturbance
200
150
100
50
1
5
10
15
20
VFAt
mmol L-1
120
110
100
90
80
70
60
25
30
35
Time (days)
disturbance
1
5
10
15
20
25
30
35
Time (days)
Figure 39. Dynamics of the pH (A), the redox potential (B), the NH3-N (C) and the total VFAs
(D).
NS stands not significant at p<0.05. Abbreviations: SBD, stability before nutritional disturbance;
SAD, stability after nutritional disturbance.
232
Etude expérimentale – Chapitre 3
B Bacteria
log copy g-1 disturbance
12.6
12.4
12.2
12.0
12.0
11.5
11.8
11.6
11.0
11.4
11.2
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
Time (days)
D Firmicutes
CFirmicutes
log copy g-1
disturbance
disturbance
log copy g-1
10.0
9.5
9.8
9.6
9.0
9.4
9.2
8.5
9.0
8.8
8.0
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
Time (days)
A Bacteria
log copy g-1 disturbance
12.5
E Bacteroides Prevotella
log copy g-1
disturbance
9.5
F Bacteroides Prevotella
log copy g-1
disturbance
10.0
9.0
9.5
8.5
9.0
8.0
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
GBacterial diversity index
7.5
7.0
disturbance
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
H Bacterial diversity index
disturbance
8
7
6
5
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 54
Time (days)
Figure 40. Dynamics of the number of gene copies of Bacteria, Firmicutes and Bacteroides
Prevotella and of the bacterial diversity index in rumen liquid fraction (A, C, E and G
respectively) and solid fraction (B, D, F, and H respectively).
233
Etude expérimentale – Chapitre 3
82
E
The number of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella logarithm gene
copies were 1%, 2% and 2% lower after the nutritional disturbance than before (P<0.001;
Tableau 22). Moreover, the liquid fraction of the rumen contained respectively 4%, 7% and
4% less Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella logarithm gene copies than the solid
fraction (P<0.001).
Before the nutritional disturbance, the number of total Bacteria, Firmicutes and
Bacteroides Prevotella gene copies spontaneously evolved in time in both fractions (P<0.01,
Figure 40), except the number Firmicutes and Bacteroides Prevotella gene copies in the solid
fraction. However, these evolutions corresponded to frequent, punctual and sporadic
fluctuations.
After the nutritional disturbance, the number of total Bacteria, Firmicutes and
Bacteroides Prevotella gene copies evolved in time in both fractions (P<0.01). These
variations are less sporadic than before disturbance but clear trends are difficult to evidence.
84
5
The bacterial diversity index decreased of 6% after the nutritional disturbance
(P<0.001; Tableau 22). The bacterial diversity index in the rumen fluid fraction was 17%
lower than in the solid fraction (P<0.001). In both ruminal fractions, the bacterial diversity
index evolved in time before and after the nutritional disturbance without clear trends
(P<0.05; Figure 40).
88
The structure of the bacterial community evolved over time in both fractions (FFMANOVA P<0.001; data not shown). However, these dynamics were not caused by the
nutritional disturbance but by sporadic and punctual fluctuations before as well as after the
disturbance (data not shown). These fluctuations explained 35% of the variance of the CESSCP profiles.
The structure of the bacterial community differed between the rumen liquid and solid
fractions (FF-MANOVA P<0.001, data not shown) but PCA showed a strong overlapping of
the bacterial community structures between both fractions (Figure 41A). Indeed, only 7% of
the variance of the CE-SSCP profiles set was explained by the ruminal fraction and
corresponded to 77% of the scans which are located throughout the CE-SSCP profile
234
Etude expérimentale – Chapitre 3
(P<0.05). These differences were more related to change in peaks relative size than in
appearance/disappearance of peaks (Figure 41B).
235
Etude expérimentale – Chapitre 3
Tableau 22. Effects of the nutritional disturbance and the ruminal fraction on the number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides
Prevotella and the bacterial diversity index.
Disturbance
Before
After
Bacteria (log copy g gross -1)
11.8 ± 0.5
Firmicutes (log copy g gross -1)
Bacteroides Prevotella (log copy
g gross -1)
Diversity index
9.3 ± 0.5
9.3 ± 0.4
11.7 ±
0.5
9.1 ± 0.5
9.1 ± 0.5
6.8 ± 0.9
6.4 ± 1.0
NS stands not significant at p<0.05.
236
liquid
Fraction
solid
Disturbance
Significance
Fraction
11.5 ± 0.5
11.9 ± 0.4
<0.01
<0.001
Disturbance
× Fraction
NS
8.9 ± 0.5
9.0 ± 0.4
9.5 ± 0.4
9.4 ± 0.4
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
NS
NS
6.0 ± 0.8
7.2 ± 0.8
<0.001
<0.001
NS
Etude expérimentale – Chapitre 3
A
PC 2
(14%)
PC 1
(23%)
B
Relative signal
intensity (× 104)
30
Rumen f luid
Feed particle
Dif f erences at p<0.05
25
20
15
10
5
77% (P<0.05)
0
0
500
1000
Scans of f ingerprint prof iles
1500
Figure 41. Effect of the ruminal fraction on the structure of the bacterial community.
A: PCA plot of the CE-SSCP profiles assessed in the rumen fluid (■) and feed particle fraction (□). B.
Mean CE SSCP profile in the rumen fluid (solid line) and in the feed particle fraction (dotted line) and
iterative test significance at P<0.05 (bold horizontal dashed line). Abbreviations: PC, principal
component.
8:
F
Relationships between the environmental parameters, the diversity index and the
number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella were reported
in Figure 42. The first two principal components explained 66% of the total variance. The first
principal component was related to the environmental parameters while the second principal
component was attributed to the variations of the bacterial community (number of gene copies
237
Etude expérimentale – Chapitre 3
of different groups of Bacteria and diversity index). Neither the bacterial group
concentrations nor the diversity index were correlated to environmental parameters.
We found any significant correlations between the structure of the bacterial
community and environmental parameters before disturbance (data not shown). After the
dietary disturbance, only the NH3-N concentration had a significant (P<0.05) correlation with
the structure of the bacterial community but it explained only 3% of the total inertia (data not
shown).
PC 2
(23%)
Bacteria Bacteroides
Prevotella
Diversity
Firmicutes
C4C2
VFAt
C3
Eh
NH3-N
pH
PC 1 (43%)
Figure 42. PCA plot of the seven environmental parameters, the diversity index and the number
of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella before ( ) and after (▲)
the nutritional disturbance.
Abbreviations: PC, principal component; C2, acetic acid; C3, propionic acid; C4, butyric acid.
:
:
The environmental parameters studied are reliable indicators of the global rumen
functioning (Kamra, 2005). They allowed characterizing the intensity of ruminal
fermentations and the main metabolic pathways involved. The nutritional disturbance induced
significant modifications of all the ruminal parameters measured as expected and as
previously reported in the literature for high-fiber vs high-grain diets. An increase of grain
238
Etude expérimentale – Chapitre 3
rate in a diet induced i) a ruminal pH decrease (Garrett et al., 1999; Goad et al., 1998 ), ii) a
lesser reductive ruminal environment (Hungate, 1966), ii) a modified fermentative pattern
with an increase of the total VFA concentration associated to increases of each level of main
VFAs (Davey, 1965 ; Shaw et al., ; Williams & Christian, 1956). VFA productions were
probably higher than the measured concentrations due to an increased of VFA absorption
under our acidic conditions (Nozière & Hoch, 2007). The low ruminal pH we measured
during high-starch challenge (after nutritional disturbance) did not generate an acidosis
ruminal state (Owens et al., 1998). Consequently, the ruminal parameters were significantly
disturbed by the nutritional challenge but the animals were not in a pathological state.
:2
The total quantity of Bacteria and its majors divisions Firmicutes and Bacteroides
Prevotella decreased slightly after the disturbance in relation with the modifications of the
environment (Ley et al., 2006). The majority of fiber-degrading bacteria in the bovine rumen
belong to the Firmicutes division (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus and
Ruminococcus flavefaciens ; Krause et al., 2003). The greater quantity of Firmicutes before
disturbance may be also attributed to higher proportion of fiber-degrading bacteria associated
with the high-fiber diet (Michalet-Doreau et al., 2001; Mosoni et al., 2007). The Bacteroides
Prevotella are involved in starch fermentation (Cotta, 1992). In consequence, the lower
quantity of this bacterial division observed during the high-starch diet supplementation (after
disturbance) contrasted with the data available in the literature. However synergistic
interactions among cellulolytic bacteria were observed during hemicellulose and pectin
degradation in vitro conditions (Dehority, 1991) and development of Bacteroides Prevotella
depended to solubilised polysaccharides released by the activities of other bacteria (Dehority,
1991; Flint, 1997). Consequently, the lower number of Bacteroides Prevotella during the
high-starch diet supplementation may be explained by the reduction of the fiber-degrading
bacteria.
Even significant, the effects of nutritional disturbance observed on the bacterial
community were of a low extent. Sadet et al. (2008) displayed any bacterial community
differences of the ovine rumen consequently to changes in dietary composition using
denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). On the opposite, most studies focusing on
the relationship between diet composition and bovine ruminal microbiota reported consistent
changes (Kocherginskaya et al., 2001; Tajima et al., 2000). Such controversial results could
be explained by difference in the composition of the diets, mainly the starch concentration,
239
Etude expérimentale – Chapitre 3
twice lower in Sadet et al. (2008) and us than in studies of Kocherginskaya et al. (2001) and
Tajima et al. (2000).
No difference on the bacterial community structure was observed before and after the
nutritional disturbance. This result corroborated the low extent of the diet switch. With the
fingerprint technique we used (CE-SSCP) a low change of the bacterial community structure
could be not detected. Indeed, the analysis of structure highlighted in majority the changes of
peaks size which are considered to be the dominant OTUs (Fromin et al., 2002; Nakatsu et
al., 2000).
:4
The dynamic of the ruminal ecosystem in absence of disturbance could be studied
thanks to the samples collected before the dietary switch. Our results demonstrated that the
majority of the ruminal environmental parameters and of the microbiota data were subjected
to variations in absence of induced disturbance. These punctual fluctuations did not evolved
to a clear trend. Similarly, a spontaneous change of the bacterial community (structure and
diversity index) was previously reported in the bovine rumen (Michelland et al., 2009c;
Monteils et al., 2009a). Interestingly, in hindgut fermentors of mammals, the bacterial
community were particularly stable: in Human (Abell et al., 2008; Abell & McOrist, 2007;
Zoetendal et al., 1998), in pig (Leser et al., 2000), in dog (Simpson et al., 2002) and in rabbit
(Michelland et al., 2009a). Such spontaneous evolution of the bacterial community in foregut
compared to hindgut mammal fermentors may be explained by the more heterogeneous
composition of the digesta incoming and more intense fermentations which both involved
great daily changes in environmental parameters. Further studies are needed to verify this
observation and may provide better understand of the global functioning of the digestive
fermentors. However, in our study, the NH3-N concentration was the only ruminal parameter
showing a significant sporadic variation. Despite this variation, we could not evidence a
correlation between the N-NH3 concentration and the bacterial community. Similarly, a long
term study, carried out on animals fed a high fibre diet without any disturbance, showed weak
time-variation of ruminal environmental parameters (Monteils et al., 2009b). The lack of
time-stability of the ruminal ecosystem in absence of disturbance required to induce a strong
nutritional disturbance to observe a significant response.
As observed before the nutritional disturbance, all the data concerning microbial
community obtained after the disturbance showed sporadic fluctuations but any clear trend
240
Etude expérimentale – Chapitre 3
could be evidenced. Similarly, in a long term study in cows fed a high-starch diet, Monteils et
al. (2009a) did not displayed a time effect on the bacterial community structure.
All these results suggested that the ruminal bacterial community never remains in a
stable state but oscillated around a steady point. That suggests that the bacterial community of
the rumen obeyed the ecological laws of the dynamic equilibrium (Tuljapurkar & Semura,
1977), previously observed in other ecosystems (Chave et al., ; Gardner et al., 2007;
Wingreen & Levin, 2006). Furthermore, these fluctuations were smaller than changes induced
by the disturbance, suggesting that the bacterial communities before and after the disturbance
were different and presented a dynamical stability around different states.
:8
Both before and after nutritional disturbance, we observed higher values of number of
gene copies of the total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and diversity index
in the solid fraction compared to the liquid fraction of the rumen content. Such different
communities between fractions of digestive ecosystem content were previously observed in
the cow (Cho et al., 2006; Tajima et al., 1999), in the sheep (Larue et al., 2005; Tajima et al.,
1999)} and in Human (Walker et al., 2008). But, in our study, the differences are of weak
amplitude and concerned more a weak modification of majority of OTUs abundance (77% of
CE-SSCP peaks) than occurrence of fraction-specific dominant OTUs. However, we observed
a higher diversity index in the solid fraction than in the liquid fraction of rumen content. The
bacteria species inhabiting the solid fraction were in contact with numerous micro-scale
conditions providing by the variety of substrates. This environmental heterogeneity promotes
more variety of micro-niches and thus more bacterial species were able to colonize it in the
solid than in the liquid fraction. This species–area relationship ecological law was previously
observed in the microbiota in salt marsh sediments ecosystems (Horner-Devine et al., 2004).
::
F
In this study, we evidenced no correlation between the bacterial communities, the
quantity of bacterial divisions and the environmental parameters before the disturbance and
significant but slight correlation with the NH3-N concentrations after the disturbance.
Undoubtedly, the environmental parameters, and more especially the reductive conditions
(measured by redox potential) and acidity (pH), are important parameters selecting bacterial
species in digestive tract (Kamra, 2005; Ley et al., 2006). The lack of correlation between the
pH and the redox potential and the microbial community could be attributed to low changes of
241
Etude expérimentale – Chapitre 3
these parameters in response to the nutritional disturbance. The NH3-N concentration was the
parameter which showed the highest variations between periods (-48% after the nutritional
disturbance) and it was the only one which was slightly correlated with the structure of the
bacterial community. In further studies, it would be interesting to apply a stronger nutritional
disturbance to study relationships between ruminal parameters and microbiota.
E
The present experiment demonstrated that a nutritional disturbance, i.e an increase of
the dietary starch/fiber ratio, induced a modification of all the environmental parameters in
the rumen environment which became less reductive, more acid and contained higher VFAs
concentrations and lower NH3-N concentrations. The bacterial community was affected by the
nutritional disturbance since the bacterial diversity index and the quantities of all bacterial
divisions decreased even if the structure of the community did not change. However, both
before and after disturbance, the community showed sporadic fluctuations suggesting a
dynamical variation around different steady points. Finally, the bacterial community was
specific to the fraction (liquid, solid) of the rumen. Relationships between environmental
parameters and microbial community remained to be elucidated.
G
I
F
The authors are grateful to technical assistance in the laboratory Carole Bannelier,
Béatrice Gabinaud, Muriel Segura, Véronique Tartie and in the breeding center Rémi
Dufresne, Brigitte Santa Cruz and Caroline Dufresne. The author thanks Christine Julien for
her help in sample collection. The work of the staff at the Centre de Ressources, Génotypage
et Séquencage of Toulouse is gratefully acknowledged.
242
Etude expérimentale – Chapitre 3
H
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Etude expérimentale – Chapitre 3
250
Etude expérimentale – Chapitre 3
>
R.J., Michelland1,2,3, S. Combes1,2,3, V. Monteils2,1,3, L. Cauquil1,2,3, T. Gidenne1,2,3,
L. Fortun-Lamothe1,2,3
Mots clés: aliment, perturbation, fibres, bacteries totales, Firmicutes, Bacteroides Prevotella,
CE-SSCP, qPCR
Titre abrégé: Perturbation nutritionnelle dans l’écosystème cæcal du lapin
Résumé
Ce travail avait pour objectif d’étudier la réponse de la communauté bactérienne du
cæcum du lapin à une réduction des apports de fibres alimentaires. Deux groupes de 60
animaux agés de 49 à 88 jours ont été alimentés à volonté avec un aliment témoin (13.6%
cellulose) ou déficitaire en fibres (7.1% cellulose, LFD). Du contenu cæcal de 5 lapins dans
chaque groupe a été collecté régulièrement à 12 dates différentes. Les communautés
bactériennes ont été caractérisées par analyse des profils CE-SSCP tandis que les bactéries
totales, les Firmicutes et les Bacteroides Prevotella ont été quantifiés par qPCR. Enfin, les
principaux paramètres environnementaux du cæcum ont été mesurés. Une réduction de la
teneur en fibres de l’aliment modifie la structure de la communauté bactérienne du cæcum
mais pas sa diversité (5.6 ± 0.8). Les quantités des principales divisions bactériennes étudiées
diminuent. L’environnement cæcal devient moins acide (+0.2 ; P<0.01), plus réducteur (-11
mV ; P<05) et contient plus de matière sèche (+3.4% ; P<0.001) et de NH3-N (+77% ;
P<0.001) mais moins d’AGV (-17% ; P<0.001). Toutes ces modifications microbiennes et
environnementales sont observables dès le deuxième jour après la perturbation et persistent
pendant toute sa durée. En conclusion, ces résultats suggèrent que la communauté bactérienne
du cæcum du lapin est capable de changement et d’adaptation rapides pour atteindre un
nouvel équilibre en réponse à une perturbation nutritionnelle.
251
Etude expérimentale – Chapitre 3
252
Etude expérimentale – Chapitre 3
/
/
>
/
R.J., Michelland1,2,3, S. Combes1,2,3, V. Monteils2,1,3, L. Cauquil1,2,3, T. Gidenne1,2,3, L. FortunLamothe1,2,3
1
INRA, UMR 1289 TANDEM, Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et
Métabolisme, F-31326 Castanet-Tolosan, France;
2
Université de Toulouse, INPT-ENSAT,
UMR 1289 TANDEM, F-31326 Castanet-Tolosan, France; 3 ENVT, UMR 1289 TANDEM, F31076 Toulouse, France.
Running title: Dietary disturbance of the rabbit cæcum ecosystem
Corresponding author. Name : L. Fortun-Lamothe. Mailing address : INRA, UMR 1289,
Tissus Animaux, Nutrition, Digestion, Ecosystème et Métabolisme, BP 32607, 31326
Castanet Tolosan Cedex, France. E-mail: lamothe@toulouse.inra.fr. Phone: 33 (5) 61 28 53
18. Fax: 33 (5) 61 28 53 19.
253
Etude expérimentale – Chapitre 3
254
Etude expérimentale – Chapitre 3
This work aimed to study the response of the bacterial community in the rabbit cæcum
to a reduction of dietary fiber supply. Two groups of 60 animals were fed ad libitum a control
(13.6% cellulose) or a low fiber diet (7.1% cellulose, LFD) from 49 to 88 days of age. Cæcal
contents of 5 rabbits of each group were collected regularly at twelve dates. The bacterial
communities were characterized by CE-SSCP and the total Bacteria, Firmicutes and
Bacteroides Prevotella were quantified by qPCR. In addition, main cæcal parameters were
measured. The reduction of fiber in the diet modified the structure of the bacterial community
of the cæcum but not the diversity (5.6 ± 0.8). The quantities of all bacterial divisions
decreased. The cæcal environment became less acid (+0.2; P<0.01), more reductive (-11mV ;
P<0.05) and dryer (+3.4% ; P<0.001) with an increase of NH3-N (+77% ; P<0.001) and a
decrease of VFA (-17% ; P<0.001). All these microbial and environmental modifications
occurred as soon as the 2nd day after the disturbance and remained stable for all its length of
time. In conclusion, these results suggested that the bacterial community in the rabbit cæcum
was able of rapid change and short settling time to a new steady state in response to a nutrient
disturbance.
Keywords: diet, disturbance, fiber, Bacteria, Firmicutes, Bacteroides Prevotella, CE-SSCP,
qPCR
255
Etude expérimentale – Chapitre 3
256
Etude expérimentale – Chapitre 3
2
Anti microbial growth promoters have been used for many decades to prevent
digestive disorder by regulating the microbial ecosystem presents in intensive-bred animal
digestive tract. Recently, the European Union (EU directive 2001/82) has banned the
administration of antibiotics as growth promoters (Casewell et al., 2003). Consequently, new
alternatives are required urgently to fight against digestive disorders in intensive-bred
animals. This has led to an increased interest on the effect of dietary components on the
gastrointestinal tract microbiota.
Digestive disorder causes high mortality rate in rabbit breeding (Peeters, 1988). For
example, in France, it reached 14% between weaning and slaughter age (Guerder, 2003).
Several studies demonstrated that the increasing of dietary fiber concentration in the diet
decreased the mortality rate (Bennegadi et al., 2001; Gidenne, 2003; Montagne et al., 2003).
This beneficial effect is related to enhanced fermentative activity in the cæcum (Carabaño et
al., 2008), through increasing the amount of cellulolytic bacteria (Boulahrouf et al., 1991).
The bacterial community of the cæcum contains mainly Firmicutes (93%) such as
Ruminococcus albus (Bennegadi et al., 2003), but also Bacteroidetes (4%; Monteils et al.,
2008) which the concentrations increase when the dietary fiber level increases (Bennegadi et
al., 2003). The cæcum contains few or no protozoa and fungi (Bennegadi et al., 2003;
Forsythe & Parker, 1985b; Lelkes, 1987; Peeters, 1988). Consequently, rabbit is a relevant
model to study relations between diet composition, gut microbiota and digestive health.
However, the effects of dietary fiber on the global structure and diversity of the bacterial
community is poorly known.
This study aimed to evaluate the response of a gastro-intestinal ecosystem to a nutrient
disturbance. We used the cæcal ecosystem of the rabbit as a model and we applied a
permanent dietary disturbance based on a low-fiber diet. The bacterial community was
characterized using two complementary molecular approaches: the capillary electrophoresis
single-stranded conformation polymorphism (CE-SSCP) to analyse the bacterial structure and
diversity, and the quantitative PCR (qPCR) to quantify the amount of Bacteria and its
principal divisions, the Firmicutes and the Bacteroides Prevotella. Simultaneously, ten
parameters were measured to characterize the cæcal environment, and to study relationships
between the bacterial community and its environment.
257
Etude expérimentale – Chapitre 3
4
4
5
A total of 120 white New Zealand x Californian rabbits were maintained in individual
cages in a controlled husbandry at the experimental unit of UMR 1289 INRA TANDEM
(Castanet-Tolosan, France). From weaning (36 days old) until the beginning of the
experiment (49 days of age), the rabbits were fed with a standard commercial diet (Rablo
Formax GVR, GCO, Castelnaudary, France) containing 13.6% cellulose, 17.4%
hemicellulose, 13.6% starch, 16.1% crude protein and 2.7% crude fat. At 49 days-old (day 0),
60 rabbits were switched to a low fiber diet for 4 weeks (LFD group). This feed was made at
UMR 1289 INRA TANDEM and contained 7.1% cellulose, 8.8% hemicellulose, 32.9%
starch, 17.1% crude protein and 2.1 % crude fat. The other 60 animals remained to be fed with
the commercial diet (control group). The rabbits were cared for in accordance with the
guidelines for animal research of the French Ministry of Agriculture (Anonymous, 27 avril
1988). Both groups of rabbits were fed ad-libitum and had free access to fresh water.
42
K
Five control rabbits and five LFD rabbits were randomly selected for sampling and
measurement purposes on days 2, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36 and 39. The rabbits were
anesthetized using 0.5 ml kg-1 of Rompun® 2% (Bayer, Leverkusen, Germany) and 0.4 ml kg1
of Imalgène® 1000 (Merial, Lyon, France). The cæcal contents (about 200 mg) were
collected surgically after incision of cæcal wall, and stored at -20°C until microbial analyses.
Then, the pH and redox potential were recorded in vivo according to the method of Kimsé et
al. (2008) using electrodes with Pt 1000 for pH and combined Pt-ring electrode for redox
potential (Unitrode Metrohm, Heriseau, Switzerland). After these measurements, the rabbits
were slaughtered using 0.3 ml kg-1 of T61® (Intervet International GmbH, Unterschleissheim,
Germany). For the determination of volatile fatty acids (VFA) concentration, 1g of cæcal
content was collected in tube containing 2ml of 2% HgCl2. Quantifications of VFA were
determined by automated gas chromatography (Chrompack CP 9000 gas chromatograph,
Chrompack B.V., Middleburg, the Netherlands) according to Playne (1985). For NH3-N
assays, 1g of cæcal content was sampled in tube containing 3ml of 2% H2SO4. NH3-N
concentrations were determined with a colorimetric method by a Continuous Flow Analyzer
(SAN++, Skalar, Norcross, Georgia,USA) as previously described by Krom (1980). Dry
matter was determined using 3g of cæcal content dried at 100°C for 24 h. Concentrations of
258
Etude expérimentale – Chapitre 3
cellulose and hemicellulose in cæcal content were determined according to the sequential
method developed by Van Soest et al. (1991).
44
5
Total genomic DNA from about 0.2 g of cæcal sample was extracted and purified with
QIAamp® DNA Stool Mini kit (Qiagen Ltd, West Sussex, England) according to the
manufacturer's instructions.
48
E
The V3 region of the 16S rRNA genes was used as a bacterial diversity marker using
the primers w49 and 5’-6FAM-labeled w34 (Delbès et al., 1998; Zumstein et al., 2000). PCR
assays with 25 cycles of amplification was performed as described previously (Michelland et
al., 2009c) using Isis DNA Polymerase (Qbiogene, Irvine, California, USA). The capillary
electrophoresis single-stranded conformation polymorphism (CE-SSCP) was performed on an
ABI Prism 3100 Genetic (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) as previously
described (Michelland et al., 2009c). CE-SSCP profiles were aligned, normalized and
diversity index was estimated using StatFingerprints program version 1.3 (Michelland et al.,
2009b) running on R version 2.8.3 (R development Core Team, 2008). Diversity index was
estimated on each CE-SSCP profile with – log10 ∑(ai)² where ai is the relative area under the
ith peak (Haegeman et al., 2008; Rosenzweig, 1995).
4:
The primers were designed or modified from literature using the software ARB
(Ludwig et al., 2004) and the 16SrDNA database SSURef_96_SILVA_04_10_08_opt.arb
generated by the SILVA project (Pruesse et al., 2007). The specificity of the primers was
evaluated by the calculation of the matching efficiency defined as the ratio of the number of
matching sequences to the total number of sequences in the target database (Yu et al., 2005).
As suggested by Smith and Osbone (2009), the design of primers and probe, amplicons size,
melting temperature (Tm), percentage of G+C bases possibility of self complementarity of the
sequence were investigated using Primer express software (version 2.0, Applied Biosystems,
Branchburg, New Jersey, USA).
Assays were performed using the ABI Prism 7900HT sequence detection system
(Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) using optical grade 384-well plates in a
final volume of 10 µl. TaqMan qPCR technology was used for absolute quantification of total
259
Etude expérimentale – Chapitre 3
Bacteria and Bacteroides Prevotella group. TaqMan reaction mixture contained 2.5 µl of
DNA template, the specific primer set at 200 µM each (Tableau 23) and 5 µl of TaqMan®
universal PCR master mix (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). SYBR
Green assays reaction mixture contained 2.5 µl of DNA template, the specific primer set at
100 µM each (Tableau 23) and 5 µl of Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA). SYBR Green qPCR technology was used for
absolute quantification of Firmicutes group. The PCR program consisted of 10 min at 94°C,
followed by 40 cycles with 15 s at 94 °C, 1 min at 60 °C. A dissociation curve was added to
SYBR Green assays to check the specificity of the amplification. At least four nonzero
standard concentrations were used in each assay.
Standard curves were generated by amplification of the serial ten-fold dilutions of
plasmid (from104 to 109 copy number) containing the 16S rRNA gene sequence of
Ruminococcus albus (acc: EF445158; 1489 pb), Butyvibrio fibrisolvens (acc: EF445262; 1504
pb) and Prevotella bryantii (acc: EF445235; 1490 pb) for quantification of total Bacteria,
Firmicutes and Bacteroides Prevotella respectively. Plasmid concentrations were measured
using NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington,
Delaware, USA). The copy number for each reaction was calculated from the standard curves.
16S rRNA-gene-targeted group primers set to Firmicutes and Bacteroides Prevotella
developed or adapted in our study (Layton et al. 2006 and Guo et al. 2008b) were highly
specific. Indeed, primers and probe for Bacteroides Prevotella quantification with zero
mismatch allowance matched with almost 92% of the targeted sequences in the database, 0%
of not-Bacteroides and not-Prevotella Bacteria (Tableau 23). Primers for Firmicutes
quantification with zero mismatch allowance matched with almost 78% of the targeted
sequences in the database and only 4% of not-Firmicutes Bacteria.
260
Etude expérimentale – Chapitre 3
Tableau 23. PCR primers and probes used for qPCR assays
Target group
qPCR assay
Primer /
Probe
sequence (5’ → 3’)
E. Coli
numbering
Size
(bp)
Tm
(°C)
Matching efficiency (%)
Target
groupα
Total Bacteria
Bact1369F
Bact1492R
TM1389F
Forward
Reverse
Probe
Bacteroides Prevotella
296F21
Forward
References
0M
2M
Upper group
minus target
groupβ
0M
2M
CGGTGAATACGTTCYCGG
TACGGCTACCTTGTTACGACTT
6FAM-CTTGTACACACCGCCCGTCMGB
1369-1386
1492-1513
1389-1407
142
59.2
54.7
58.6
80
ND
58
92
ND
77
0
ND
0
1
ND
34
GAGAGGAAGGTCCCCCACATT
296-316
110
60.1
92
99
0
0
385R21
Reverse
CACGCTACTTGGCTGGTTCAG
385-405
59.5
98
100
0
3
375R29
Probe
6FAM-CCATTGACCAATATT
CCTCACTGCTGCCT-TAMRA
375-404
69
98
100
5
27
Firmicutes
Firm1048F20
Forward
ACAGGTGGTGCATGGTTGTC
1048-1066
57.9
90
100
4
70
Firm1196R23
Reverse
CATAAGGGGCATGATGATTTGAC
1196-1217
59.2
78
99
4
18
170
(Suzuki et al., 2000)
(Firmesse et al., 2007)
(Suzuki et al., 2000)
(Layton et al., 2006) modified in this
study
(Layton et al., 2006) modified in this
study
(Layton et al., 2006)
(Guo et al., 2008a) modified in this
study
This study
We used the SILVA database SSURef_96_SILVA_04_10_08_opt.arb (Pruesse et al., 2007) with an align quality up to 75% and a pintail up to 50%. The
matching efficiency of primers and probe was calculated as the ratio of the number of matching sequences to the total number of sequences in the target
database. α: the target group matching efficiency were calculated with specific databases for total Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes qPCR
assays and contained respectively 249635, 14359 and 89610 sequences. β: the upper group minus target group matching efficiency corresponded to total
Eucarya plus Archaea, total Bacteria minus Bacteroides Prevotella and total Bacteria minus Firmicutes, respectively for the total Bacteria, Bacteroides
Prevotella and Firmicutes qPCR assays. The upper group minus target group databases contained 36996, 235276 and 160025 sequences, respectively for the
total Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes qPCR assays. Abbreviations: Tm, melting temperature according to Primer express software (version
2.0, Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA); M, mismatch; ND, not determined.
261
Etude expérimentale – Chapitre 3
4E
Environmental parameters, qPCR data and the diversity index were subjected to
analysis of variance (ANOVA) and Tukey's HSD post-hoc test using dietary treatment (2
levels), day of sampling (12 levels) and their interaction as fixed effects (R development Core
Team, 2008).
The CE-SSCP profiles data were explored using a centered and scaled PCA and tested
with a fifty-fifty multivariate ANOVA (FF-MANOVA) with 10000 rotations (Langsrud,
2002; Langsrud, 2005). FF-MANOVA was performed using dietary treatment, day of
sampling and their interaction as fixed effects. When an effect was significant, an iterative
Mann-Whitney test was applied on each scan of the CE-SSCP profile to identify the scan
position which differed along the CE-SSCP profile. Such analyses on CE-SSCP profiles are
refered in the text as analysis of the structure of the bacterial community.
The correlations between the environmental parameters, the diversity index and the
number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella, were
analysed using a centered and scaled PCA. The correlation between the structure of the
bacterial community (whole CE-SSCP profiles data) and the environmental parameters set
was tested using redundancy analysis (RDA) with 10000 Monte Carlo permutations
(Legendre & Legendre, 1998). Prior to the RDA, the environmental parameters included in
the model were selected using a stepwise selection. As environmental parameters were
expressed in different units, they were transfromed to have similar mean (0) and variance (1)
prior to RDA.
8
There were no significant differences in mortality (12%, 17% respectively for the
control and LFD rabbits; NS), daily weight gain (49 g day-1, 47 g day-1 respectively for the
control and LFD rabbits; NS) and body weight at the end of the study (2748 g, 2667 g
respectively for the control and LFD rabbits; NS) between the control and the LFD group. As
expected, the daily feed intake of the LFD rabbits was 25% lower than the control rabbit.
Consequently, the mean daily fiber intake was 189 g day-1.and 142 g day-1, respectively for
the control and LFD rabbits.
262
Etude expérimentale – Chapitre 3
Tableau 24. Effect of the diet on the cæcal environmental parameters, the number of gene copies
of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella and the bacterial diversity index.
Diet
Environmental
Cellulose (%)
parameters
Hemicellulose
(%)
pH
Redox potential
(mV)
Dry matter (%)
NH3-N (mmol
L-1)
VFAtotal (mmol
L-1)
C2 (mmol L-1)
Microbial data
Significance
Dietary
LFD
14.3 ± 3.6
11.6 ± 3.0
<0.001
NS
NS
16.9 ± 3.7
13.9 ± 3.0
<0.001
NS
NS
6.1 ± 0.3
6.3 ± 0.3
<0.01
NS
NS
-192 ± 26
-203 ± 22
<0.05
NS
NS
20.3 ± 2.3
23.7 ± 2.5
<0.001
6.0 ± 3.3
10.6 ± 6.2
<0.001
NS
NS
<0.001
NS
NS
<0.001
NS
NS
94.7± 16.6
73.1± 13.8
78.4 ±
18.0
56.3 ±
14.0
treatment
Time
Treatment
Control
<0.00
1
× Time
NS
C3 (mmol L-1)
4.9 ± 1.5
4.7 ± 1.6
NS
<0.01
NS
C4 (mmol L-1)
14.8 ± 4.4
14.9 ± 7.2
NS
NS
NS
12.4 ± 0.4
12.2 ± 0.5
<0.01
NS
NS
8.6 ± 0.4
8.3 ± 0.3
<0.001
NS
NS
8.0 ± 0.4
7.7 ± 0.5
<0.01
NS
<0.05
5.7 ± 0.8
5.5 ± 0.8
NS
<0.05
<0.05
Total Bacteria
(log copy g-1)
Firmicutes (log
copy g-1)
Bacteroides
Prevotella (log
copy g-1)
Diversity index
NS, non significant at P<0.05. Abbreviations: C2, acetic acid; C3 propionic acid; C4 butyric acid.
Mean ± standard deviation.
263
Etude expérimentale – Chapitre 3
8
As expected, the diet composition greatly affected the chemical composition of the
cæcal environment (Tableau 24). The cæcal cellulose and hemicellulose contents were lower
in the LFD than in the control rabbits (-2.7 % and -3 % respectively; P<0.001). The cæcal
content of the LFD rabbits was a less acid (+0.2 unit), more reductive (-11 mV) and dryer
(+3.4 %) environment than those of the control rabbits (P<0.05). Concentration of total VFAs
in the cæcal content was lower (-17 %; P<0.001) in LFD group than in control rabbits. This
result was explained by a lower acetic acid level (-23 %; P<0.001) in cæcum of the LFD
rabbits than of control rabbits. Moreover NH3-N concentration was 77% higher in the LFD
than in the control rabbit (P<0.001). In both groups, the chemical composition of cæcal
content did not varied along the experiment, except the percentage of dry matter and the
concentration of propionic acid which exhibited punctual and sporadic fluctuations (P<0.01;
data not shown).
E
82
The number of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella gene copies were
significantly lower in the cæcal contents of the LFD than of the control rabbits (P<0.01;
Tableau 24, Figure 43). The number of total Bacteria and Firmicutes gene copies did not
differ between days of sampling in both groups. The number of gene copy of Bacteroides
Prevotella did not varied over time in control rabbits but showed sporadic fluctuation in LFD
rabbits (P<0.05 on days 22, 25, 32 and 39).
84
The bacterial diversity index was similar in the cæcum of the control and the LFD
groups (Tableau 24, Figure 43) and was stable during the experiment in control rabbits. On
the opposite, in LFD rabbits it was lower on day 11 and higher on day 39 than on other days
of sampling (P<0.05).
264
Etude expérimentale – Chapitre 3
12.4
12.0
11.6
Diversity index
Bacteroides Prevotella
Log copy g-1
Firmicutes
Log copy g-1
All bacteria
Log copy g-1
12.8
1
5
10
15
20
25
Time days)
30
35
1
5
10
15
20
25
Time days)
30
35
1
5
10
15
20
25
Time days)
30
35
1
5
10
15
20
25
Time days)
30
35
9.2
9.0
8.8
8.6
8.4
8.2
8.0
8.0
7.5
7.0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
Figure 43. Dynamics of the number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides
Prevotella and the bacterial diversity index in control (dashed line) and low-fiber diet rabbits
(solid line).
265
Etude expérimentale – Chapitre 3
88
The structure of the bacterial community of the cæcum differed significantly between
the control and LFD rabbits (P<0.001). However, only 2% of the variance of the CE-SSCP
profiles set was explained by the dietary treatment according to the FF-MANOVA (data not
shown). That was evidenced in PCA analysis which showed showed a strong overlapping
between both groups (Figure 44A). However, the differences in the bacterial community
between the LFD rabbits and the control rabbits concerned 60% of the scans, which are
located throughout the CE-SSCP profile (Figure 44B). These structure modifications were
more related to change in peak relative size than in appearance/disappearance of peak. In both
groups, the structure of the cæcal bacterial community did not differ over time (data not
shown).
B
A
Relative
Signal
intensity
20
15
10
5
2% (P<0.05)
0
0
500
1000
1500
Scans of fingerprint profiles
Figure 44. Effect of the diet on the structure of the bacterial community.
A: PCA plot of the CE-SSCP profiles assessed in the LFD (▲) and control (∆) rabbits. B. Mean CE
SSCP profile in the LFD (solid line), and control (dotted line) rabbits and iterative test significance at
P<0.05 (bold horizontal dashed line).
8:
F
PCA analysis was performed to study the relationship between the environmental
parameters, the diversity index and the number of gene copies of total Bacteria, Firmicutes
and Bacteroides Prevotella (Figure 45). The first three principal components explained 57%
of total variance. On the first principal component, gene copies number for total Bacteria,
Firmicutes and to a lesser extend Bacteroides Prevotella variables were positively related to
266
Etude expérimentale – Chapitre 3
total VFAs and acetic acid and negatively to pH value. Hemicellulose and cellulose were
strongly correlated to the second axis and thus were not correlated to 16SrDNA copy number.
As shown on the PCA plot, the bacterial diversity index was not correlated to environmental
parameters.
PC 2
(18 %)
Dry
Matter
C4
NH3-N
Eh
VFA
total
C3
C2
pH
Hemicellulose
Cellulose
PC 1 (26 %)
Figure 45. PCA plot of the ten environmental parameters, the diversity index and the number of
gene copies of total Bacteria, Firmicutes and Bacteroides Prevotella assessed in the low-fiber diet
(▲) and control ( ) rabbits.
Abbreviations: C2, acetic acid; C3, propionic acid; C4, butyric acid.
8E
F
In both groups, the environmental parameters constrained few the total inertia of the
bacterial community structure (14% and 7% for the control and the LFD rabbits,
respectively). In the control rabbits, the structure of the bacterial community was correlated to
the total VFA concentrations (P<0.01) and subsequent relative concentrations: acetic
(P<0.01), propionic (P<0.001) and butyric (P<0.01) acids (Figure 46). In the LFD rabbits, the
structure of the bacterial community was correlated to the propionic (P<0.05) and butyric
(P<0.05) acids.
267
Etude expérimentale – Chapitre 3
100%
90%
80%
70%
residual
total VFAs
butyric acid
propionic acid
acetic acid
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
**
**
**
***
Control
*
*
LFD
Figure 46. Variance partitioning with partial RDA of CE-SSCP data from control and low-fiber
diet rabbits according to the stepwise selected environmental parameters.
Abbreviations: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
:
Fiber corresponds to a heterogeneous group of chemical compounds composed mainly
of cellulose and hemicellulose and in a lesser proportion pectin, gums, mucilages and lignin.
The beneficial role of fiber on the rabbit health has been well documented (Bennegadi et al.,
2001; Gidenne, 2003; Montagne et al., 2003) and is mostly based on enhanced fermentative
activity in the cæcum (Carabaño et al., 2008). Molecular methods, here CE-SSCP coupled
with qPCR, permitted to study the effects of a reduction of the dietary fiber concentration on
composition, structure and diversity index of the cæcal bacterial community. The reduction of
6.5% of cellulose and 8.6% of hemicellulose in the dietary supply can be considered as a
drastic reduction of fiber for the abilities of the rabbit digestive physiology but it
corresponded to a slight disturbance for the cæcal ecosystem since it cellulose and
hemicellulose contents decreased only of 2.7% and 3% respectively. The reduction of fiber
decreased the feed intake of animals, which permits them to maintain their energy intake
(Gidenne et al., 2000; Lebas et al., 1982; Partridge et al., 1989). This disturbance affected
both the quantity of main bacteria and the structure of the bacterial community as well as its
environment. These changes could be measured two days after the beginning of the
disturbance and remained throughout all challenge.
268
Etude expérimentale – Chapitre 3
:
When reducing the fiber content in fermentative compartment, the structure of the
bacterial community of the rabbit changed. In the hindgut fermentors of other mammals,
studies concerning the effect of dietary fiber levels on bacterial community lead to
contradictory results. In the pig, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)
analysis demonstrated that some OTUs were specific to dietary treatment while others were
commons (Leser et al., 2000). In contrast, in the dog, denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE) analysis did not evidence any differences of the structure of the bacterial community
when reducing of 10% the fiber level (Simpson et al., 2002). These controversially results
may be partly attributed to the magnitude of the disturbance and/or the buffering capacity of
fermentors of each mammal species. In this study, the reduction of fiber level in the cæcum
was sufficient to modify the bacterial community structure as well as the quantity of Bacteria
and its major divisions. However, these modifications are of weak amplitude and did not
affect the diversity index. Consequently, the disappearance of some species as a consequence
of nutritional disturbance could be compensated by hidden species able to perform similar
functions (Cardinale et al., 2002; Zoetendal et al., 2004). A stronger or earlier dietary
interventions than applied in this study seemed to be required to cause profound bacterial
community changes with less functional redundancy possibility.
:2
;
The cæcal environment was dryer, less acid and more reductive when the dietary fiber
level decreases. We observed changed in the fermentative pattern with a decrease in the VFA
production and an increase in the NH3-N production. The increase of pH we observed may be
explained by the lower quantity of VFA and especially of the acetic acid produced by the
bacterial community. A lower production of VFA in the rabbit cæcum was previously
described to be attributable to a decrease of the number of cellulolytic bacteria (Boulahrouf et
al., 1991). Ruminococcus flavefaciens, Fibrobacter succinogenes and R. albus were present in
the rabbit cæcum (Abecia et al., 2005; Bennegadi-Laurent et al., 2004; Monteils et al., 2008)
and have been shown responsible of cellulolyse in other animals (Daly et al., 2001; Krause et
al., 2003). In our study, the decrease of the Firmicutes quantity and of the VFA concentration
tends to comfort this assumption. We found that the reduction of fibers did not induce an
increase of the butyric acid, in contrast with previous reports (Bellier & Gidenne, 1996;
Bennegadi-Laurent et al., 2004; Gidenne et al., 2000). In the rabbits, the butyric acid was
previously described to be attributed to Bacteroidetes (Vernay & Marty, 1984) and an
269
Etude expérimentale – Chapitre 3
increase of the Bacteroidetes quantity was observed when reducing the fibers intake
(Bennegadi et al., 2003). In contrast with this study, we found a significant but slight decrease
of the quantity of Bacteroides Prevotella while the butyric acid concentration did not change.
:4
;
The dynamic of the cæcal ecosystem in absence of disturbance could be studied thanks
to the control rabbits. Our results demonstrated that the bacterial community (structure,
quantity of Bacteria, Bacteroides Prevotella and Firmicutes) and the environmental
parameters (except dry matter) of the cæcum were stable over the 39 days of the experiment.
Several studies previously demonstrated stability in the hindgut fermentor in rabbit
(Michelland et al., 2009a), in Human (Abell et al., 2008; Abell & McOrist, 2007; Zoetendal et
al., 1998), in pig (Leser et al., 2000) and in dog (Simpson et al., 2002). Such stability may be
partly attributed to the constant composition of nutrients entering the cæcum due to the
constant composition of the diet and the distal position of this organ. We surprisingly found a
stable bacterial community and no fluctuation of the environmental parameters in the rabbits
fed a low-fiber diet. This stability means that the bacterial community was quickly adapted to
the environmental modification, as soon as before the 2nd day after disturbance. The rapid
adaptation of the bacterial community may be due to the slight amplitude of changes, induced
by the disturbance, on the environmental parameters. In this study, the animals were fed the
low-fiber diet pellet until the end of the experiment. Thus, we assume that the permanent
disturbance may maintain stable the bacterial community as soon as adapted to the
disturbance. All these results suggested that the bacterial community was able of rapid change
and short settling time to a new equilibrium state in response to a dietary disturbance.
:8
F
;
In this study, we evidenced significant but slight correlations between the bacterial
communities, the quantity of bacterial divisions and the environmental parameters. The
reductive conditions (measured by redox potential) and acidity (pH) was previously described
as important parameters selecting bacterial species in digestive tract of other animals (Kamra,
2005). Strikingly, in our study the pH was only correlated to total Bacteria and Firmicutes
quantities whereas the redox potential were not correlated to microbiota data. We assume that
this lack of correlation of the pH and the redox potential may be attributed to the low change
of these parameters in response to the dietary disturbance. In further studies, it would be
270
Etude expérimentale – Chapitre 3
interesting to applied the nutritionnal disturbance in younger animals, in which cæcal
parameters are not stabilized, to hope better evidenced the correlations.
E
In conclusion, the rabbit is a relevant model to study the effect of dietary composition
on the bacterial community of mammals with hindgut fermentors in order to devise
approaches for enhancing animal health outcomes. The present experiment demonstrated that
a reduction of the dietary fiber concentration modified slightly the structure of the bacterial
community of the cæcum, decreased the quantities of all bacterial divisions but did not change
the diversity index. The cæcal environment became more reductive and less acid due to an
increase of NH3-N and a decrease of VFA concentrations. All these microbial and
environmental modifications are measurable 2 days after the beginning of the challenge and
remained throughout it. These results suggested that the bacterial community of rabbit cæcum
was able of rapid change and short settling time to a new equilibrium state in response to a
nutritionnal disturbance. Future studies should be designed with an earlier dietary intervention
to test the susceptibility of the bacterial community in young animals and to better
characterize the overall effect of the fiber quantity on the rabbit health.
G
I
F
The authors are grateful to technical assistance in the laboratory Carole Bannelier,
Béatrice Gabinaud, Muriel Segura, Véronique Tartie and in the breeding center Patrick
Aymard, Jacques De Dapper, Jean De Dapper, André Lapanouse. The work of the staff at the
Centre de Ressources, Génotypage et Séquencage of Toulouse is gratefully acknowledged.
271
Etude expérimentale – Chapitre 3
H
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276
277
278
Discussion générale
Notre travail avait pour objectif de caractériser à l’aide d’outils moléculaires les
écosystèmes digestifs dans deux espèces de mammifères herbivores : la vache et le lapin. Pour
cela nous avons réalisé d’importants efforts méthodologiques pour la mise au point des
techniques de CE-SSCP (bactéries et Archaea) et de qPCR (Bactéries totales, Firmicutes and
Bacteroides Prevotella) et l’exploitation statistique des profils CE-SCCP. A l’issue de ces
mises au point nous avons étudié l’influence de différents facteurs de variation des
écosystèmes digestifs dans les deux espèces afin de pouvoir réaliser une approche comparée
entre les deux fermenteurs.
Néanmoins, cette volonté de réaliser une approche comparée a été confrontée aux
différences physiologiques entre les deux espèces. Ainsi, certains choix méthodologique
valides pour une espèce pouvaient se réveler des non sens physiologiques pour une autre. Par
exemple, chez la vache, nous avons distribué deux repas par jour, de manière contrôlée. Nous
avons ensuite pu étudier l’évolution des communautés bactériennes et des paramètres
fermentaires au cours de la période post prandiale. Cette situation n’a pas de sens chez le
lapin. En effet, cet animal réalise de très nombreux repas au cours de la journée (20 à 30
repas). De plus, le cæcum étant situé en aval du tube digestif, le flux des nutriments entrant
dans ce fermenteur est plus régulier et plus indépendant de l’ingestion de l’hôte. Le contenu
ruminal est hétérogène et il a été démontré précédemment que les populations attachées aux
particules alimentaires sont différentes de celles vivant de façon planctonique dans la parte
liquide du rumen. Nous avons donc introduit ce facteur de variation (fraction solide ou
liquide) dans nos études pour la vache. En revanche, le contenu cæcal est pâteux et homogène
et cette notion de fraction n’a pas de sens chez le lapin. Par ailleurs, les modèles de
perturbation nutritionnelle appliqués dans les deux espèces sont de même nature
(augmentation du ratio amidon/fibres) mais ont été réfléchis pour avoir un sens vis-à-vis des
besoins nutritionnels et de la physiologie des deux espèces étudiées. Enfin, en raison de la
taille de l’animal, le nombre d’animaux utilisé peut être plus important chez le lapin que chez
la vache, surtout pour des vaches porteuses de canule. Afin de gagner en puissance
expérimentale, nous avons choisi de profiter de cette possibilité pour travailler sur des
effectifs plus importants chez le lapin.
C’est pour l’ensemble de ces raisons, que les schémas expérimentaux ne sont pas
toujours identiques entre les deux espèces étudiées et qu’ils ont aboutis à des publications
parfois séparées (à l’exception de la publication sur les Archaea). En revanche, au sein de la
279
Discussion générale
discussion générale, les résultats sont discutés sous l’angle d’une approche comparée entre les
deux espèces modèles.
Dans la partie qui va suivre, nous allons dans un premier temps réaliser une analyse
critique des méthodologies utilisées, en évaluant leurs pertinences, intérêts et limites pour
atteindre nos objectifs. Dans un deuxième temps, nous réaliserons une approche comparée des
écosystèmes digestifs (rumen, cæcum et feces) et discuterons de l’importance relative de
différents facteurs de variation sur la variabilité de ces écosystèmes. Enfin, nous présenterons
les relations entre le biotope et le microbiote.
D’une point de vue méthodologique, l’originalité et la force de notre travail résident
dans i) le couplage des diverses techniques récentes de biologie moléculaire (CE-SCCP et
qPCR) pour la caractérisation du microbiote digestif avec la mesure des paramètres du
biotope (pH, potentiel redox et paramètres fermentaires) afin d’avoir une approche plus
exhaustive des écosystèmes digestifs, ii) l’utilisation et le développement de méthodes
d’exploitation des informations contenues dans les profils CE-SSCP pour caractériser les
communautés bactériennes à la fois dans leur diversité et leur structure, et iii) la création
d’un logiciel libre de droits, StatFingerprints, pour rendre accessible à la communauté
scientifique nos recherches sur le traitement et l’analyse des profils CE-SSCP.
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1-
Dans ce travail de thèse, nous avons choisi d’utiliser la CE-SSCP comme technique
d’empreinte moléculaire pour étudier les communautés des écosystèmes digestifs chez la
vache et le lapin. Nous pouvons identifier trois limites à la méthode utilisée pour la
réalisation de nos objectifs.
La première limite concerne les biais inhérents à l’extraction et de la purification
de l’ADN (Luna et al., 2006 ; Martin-Laurent et al., 2001; Stach et al., 2001 ; Tang et al.,
2008) et à l’amplification par PCR : choix des amorces, choix de l’enzyme et
amplification différentielle (Zhu et al., 2002). Pour l’extraction nous avons utilisé le kit
d’extraction QIAmp® DNA Stool Mini kit (Qiagen Ltd, West Sussex, Angleterre) qui a été
montré comme efficace pour les écosystèmes digestifs (Li et al., 2003). En ce qui concerne
l’amplification par PCR, les premiers essais de notre travail (Etude expérimentale – Chapitre
280
Discussion générale
2) ont été réalisés avec l’enzyme Pfu Ultra II Fusion HS DNA polymerase (Stratagene) avec
30 cycles PCR. Cependant, des essais ultérieurs réalisés dans notre laboratoire (Combes et al.
communication personnelle) ont montré, en accord avec les résultats de Zinger et al. (2007),
que l’enzyme Isis DNA Polymerase (Qbiogene, Irvine, California, USA) produit une plus
grande quantité d’amplicons pour une haute fidélité. Par conséquent, les dernières études
(Etude expérimentale – Chapitre 3) ont été réalisées avec l’enzyme Isis DNA Polymerase. De
plus, l’utilisation de 30 cycles d’amplification avec l’enzyme Isis DNA Polymerase sur les
échantillons provenant du lapin a montré que les profils CE-SSCP saturaient. C’est pourquoi
les derniers essais (Etude expérimentale – Chapitre 3) ont été réalisés avec 25 cycles
d’amplification PCR pour les échantillons prélevés chez le lapin et 30 cycles d’amplification
pour les échantillons prélevés chez la vache.
La deuxième limite de notre travail porte sur le fait que la CE-SSCP est fréquemment
associée à des phénomènes de co-migration, de façon d’autant plus importante que la
communauté est diverse. De ce fait, un seul pic ne correspond pas toujours à une seule espèce
mais peut être associé à un assemblage d’espèces (Kowalchuk & Stephen, 2001 ; Loisel et al.,
2006; Schmalenberger & Tebbe, 2003 ; Zinger et al., 2007). Ainsi, Loisel et al. (2006) ont
montré que dès qu’un milieu contient plus de 100 espèces des phénomènes de co-migrations
sont systématiquement observés en CE-SSCP. Les pics du profil CE-SSCP ne représentent
alors que les espèces dominantes du microbiote (Fromin et al., 2002; Nakatsu et al., 2000).
Plus ces phénomènes de co-migration sont importants, plus le signal est saturé, et plus les
modifications de profils que l’on observe concernent les espèces majeures du microbiote et
non les espèces mineures. Pour diminuer ces phénomènes de co-migration, une des solutions
serait de réaliser les études sur des groupes phylogéniques plus restreints, regroupant donc
moins d’espèces, à l’aide de couples d’amorces plus spécifiques. Les CE-SSCP seraient alors
réalisées sur chacun de ces sous groupes bactériens et aboutiraient à des profils non ou moins
saturés (Combes et al. communication personnelle). Ces phénomènes de co-migration ont
probablement génés notre analyse des résultats des 2 derniers essais (Etude expérimentale –
Chapitre 3). Ainsi, nous avons observé une modification des quantités de bactérie, Firmicutes
et Bacteroides Prevotella en qPCR mais n’avons pas pu mettre en évidence de façon
parrallèle des modifications de la structure globale de la communauté bactérienne en CESSCP.
D’autre part, la technique de CE-SSCP ne permet pas l’affiliation phylogénétique
des pics observés contrairement aux techniques de migration traditionnelle sur gel pour
281
Discussion générale
lesquelles un séquençage peut être réalisé après excision des bandes du gel (Costa et al.,
2006 ; Mohr & Tebbe, 2006; Schmalenberger & Tebbe, 2003). Pour les techniques basées sur
une migration en capillaire, seule la T-RFLP permet une probabilité d’affiliation taxonomique
par identification des fragments en fonction de la taille dans des bases de données spécifiques.
Une migration d’espèces identifiées après clonage pourrait permettre en théorie une
assignation à postériori des pics obtenus au cours d’un essai en fonction de l’abscisse du pic.
En effet, la migration avec la méthode CE-SSCP a été montrée très reproductible (Hong et al.,
2007; Hori et al., 2005). Toutefois, le travail préalable de clonage et de séquençage est très
long et n’a pas encore été réalisé dans les écosystèmes qui nous intéressent. De plus, il
faudrait que le travail d’affiliation phylogénétique se fasse sur des profils CE-SSCP ne
présentant pas de phénomène de co-migrations, notament en découpant la commnauté
bactérienne en divisions principales.
2
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Les modalités de traitement des profils CE-SSCP proposées par la majorité des
programmes existants (GeneMarker de SoftGenetics Inc, DAx de Van Mierlo program ou
GeneScan d’Applied Biosystems) restent rudimentaire et consistent à aligner les profils sur
l’axe des abscisses et à normaliser les courbes avec un minimum de paramétrage possible. Ce
traitement des profils CE-SSCP reste insuffisant pour une exploitation optimale (Zemb et al.,
2007). Ainsi, par exemple, il a été montré que le bruit de fond sous les pics devait ête analysé
(Loisel et al., 2006). C’est la raison pour laquelle, dans ce travail de thèse, nous avons
développé des algorithmes pour traiter de façon plus efficace les profils CE-SSCP. Ces
algorithmes ont été regroupés dans un porgramme informatique -StatFingerprints-. En ce qui
concerne le traitement des profils et par rapport aux autres programmes existants (hormis
Safum de Zemb et al. 2007), le programme StatFingerprints permet de i) de ré-orienter la
ligne de base des profils, ii) d’aligner l’axe des ordonnées des profils, iii) de paramétrer
complétement l’algorithme de détection des pics au sein des profils, et iv) de prendre en
compte l’information contenu dans le bruit de fond aussi bien pour l’estimation de la diversité
que pour l’analyse de la structure.
Toutefois, des améliorations pourraient être apportées, notamment en développant des
algorithmes pour supprimer de façon objective les pics artefacts au sein des profils. En effet,
les techniques actuelles utilisent un seuil définit par l’utilisateur de façon arbitraire au-dessous
duquel les pics de tous les profils sont considérés comme des artefacts (Osborn et al., 2000).
282
Discussion générale
Une amélioration consisterait à définir un seuil optimal pour chaque profil avant de les
normaliser. Des valeurs de seuil propre à chaque profil peuvent ainsi être calculées en divisant
l’aire totale de chaque profil par un diviseur commun. Ensuite les pics de chaque profil dont
l’aire est inférieure au seuil de ce profil sont supprimés et la proportion entre l’aire initiale du
profil CE-SSCP et le nombre de pics restant est calculée. En répétant ces étapes avec des
diviseurs différents, on peut ainsi définir un diviseur optimal en gardant celui qui engendre le
ratio aire totale initiale/ nombre de pics restant le plus constant parmi tous les profils du jeu de
données. Ce diviseur optimal engendre un seuil propre à chaque profil qui permet de
distinguer de façon objective les pics artefacts des vrais pics.
4
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La diversité microbienne est un indicateur qui prend en compte le nombre d’espèces
(richesse) et l’abondance relative de chaque espèce. Cependant, les techniques d’empreintes
moléculaires ne permettent pas de connaître la richesse réelle de l’échantillon car les espèces
les plus rares sont masquées par les espèces dominantes lors des phénomènes de co-migration
(Forney et al., 2004; Pedros-Alio, 2006). L’importance de ces phénomènes de co-migration
peut être renseignée en analysant le bruit de fond sous les pics du profil CE-SSCP (Loisel et
al., 2006). Dans ce travail de thèse, ce bruit de fond a été pris en compte dans le calcul de la
diversité en utilisant l’algorithme développé par Haegeman et al. (2008). La diversité calculée
ainsi à partir des profils CE-SSCP correspond à une très bonne estimation de la diversité
réelle de Simpson et ce, quelle que soit la richesse ou la régularité de l’abondance relative des
espèces (Haegeman et al., 2008).
8
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Notre travail concernant la structure des communautés bactériennes a consisté en une
analyse fine des profils CE-SSCP : i) apparition ou disparition de pics, ou ii) modification de
l’abondance relative des pics en fonction des facteurs de variation étudiés. Ce travail fait
appel à des analyses statistiques multivariées. En effet, les profils CE-SSCP sont comparés
deux à deux pour produire une matrice de proximité. Pour explorer cette matrice, les profils
peuvent être classés hiérarchiquement sous forme de dendogramme ou bien représentés sous
forme de points agencés les uns par rapport aux autres en utilisant une méthode d’ordination
telle que l’ACP ou le nMDS (Legendre & Legendre, 1998). Toutefois, il est important de
noter que les résultats du classement hiérarchique dépendent fortement de l’algorithme utilisé
et que les techniques d’ordination et de classement hiérarchique engendrent des pertes
283
Discussion générale
d’information (Kropf et al., 2004). C’est pourquoi, la seule observation visuelle de ces
représentations pour l’analyse de la structure de la communauté comme cela est fréquemment
réalisé, est, à notre avis, insuffisante et doit être confirmée par un test statistique. Dans notre
travail, nous avons systématiquement conforté les observations de regroupements au sein des
ordinations par des tests statistiques tels que l’ANOSIM ou la FF-MANOVA. De plus,
lorsque les regroupements (par facteurs de variation) ont été significatifs, nous avons
déterminé quels pics au sein des profils CE-SSCP expliquent les différences entre les
regroupements en utilisant des tests statistiques univariés sur chaque scan des profils CESSCP. Cette analyse est rarement appliquée et permet pourtant de rendre compte des
modifications de pics par rapport aux facteurs de variation. En revanche, l’identification des
pics eux-mêmes, comme une suite de scans consécutifs, s’est révélée très délicate en raison de
la difficulté à classer certains pics au sein de catégories définies par des fenêtres de scans. En
effet, lors d’essais préliminaires, il nous a été impossible de classer certains pics au sein de
catégorie car ils chevauchaient deux catégories prédéfinies. De plus, nous pensons que la
détection de ces pics nécessite de faire des choix arbitraires : i) définition de seuil arbitraire au
deçà duquel les pics sont considérés comme des artefacts, et ii) définition du début et de la fin
d’un pic.
La plupart des méthodes statistiques que nous avons mis en œuvre n’ont, à notre
connaissance, pas été utilisées pour l’analyse des profils moléculaires des écosystèmes
digestifs. En ce sens, notre travail apporte une contribution significative à la
compréhension et aux méthodes d’études de ces écosystèmes.
En résumé, nous avons choisi d’utiliser la CE-SSCP pour une caractérisation
globale de l’ensemble de la communauté microbienne des fermenteurs digestifs de la
vache et du lapin. En effet, bien qu’elle soit exposée aux biais relatifs à toutes les
techniques basées sur la PCR (biais d’extraction et de purification de l’ADN, biais
d’amplification PCR), la CE-SSCP est une des techniques les plus robustes et les plus
sensibles. Elle est donc parfaitement adaptée pour discriminer les nombreuses espèces
présentes dans les fermenteurs digestifs. Toutefois sa résolution reste insuffisante au
regard de la diversité spécifique et de ce fait des saturations du signal CE-SSCP sont
observées. En conséquence, les outils d’analyse utilisés et les interprétations faites des
résultats doivent prendre en compte ces phénomènes de saturation. Tout au long de ce
travail, nous avons limité autant que possible ce biais, notamment par l’utilisation d’un
indice de diversité adapté.
284
Discussion générale
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Dans les écosystèmes digestifs de la vache (Kocherginskaya et al., 2001 ; Tajima et
al., 1999) et du lapin (Abecia et al., 2005; Monteils et al., 2008), les bactéries présentes se
divisent en deux divisions largement majoritaires : les Firmicutes et les Bacteroidetes. De
plus, au sein de la division Bacteroidetes, les taxons présents dans les systèmes digestifs sont
les Bacteroides Prevotella. Dans ce travail de thèse, nous avons donc choisi de diviser la
communauté bactérienne en ces deux groupes largement majoritaires les Firmicutes et les
Bacteroides Prevotella afin de mieux caractériser les populations bactériennes. La plupart des
auteurs s’attachent davantage à caractériser des micro-organismes responsables de voies
métaboliques majeures comme la fibrolyse (Denman & McSweeney, 2006; Koike &
Kobayashi, 2001 ; Krause et al., 2000 ; Mosoni et al., 2007). Toutefois, plusieurs travaux
récents s’efforcent de caractériser les Firmicutes et les Bacteroides Prevotella car le ratio
Firmicutes/Bacteroides Prevotella serait en corrélation directe avec l’obésité chez l’Homme
(Armougom & Raoult, 2008; Ley et al., 2005 ) et le porc (Guo et al., 2008a) ainsi que la santé
digestive chez l’Homme (Hopkins & Macfarlane, 2002).
2
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Au cours de notre travail, nous avons défini de nouvelles amorces pour quantifier les
Firmicutes et les Bacteroides Prevotella. La spécificité des amorces a été évaluée en calculant
le pourcentage de séquences hybridées par les amorces du groupe ciblé d’une part
(hybridation spécifique) et d’autre part des groupes non ciblés (hybridation non spécifique) en
utilisant
le
logiciel
ARB
(Ludwig
et
al.,
2004)
avec
la
base
de
données
SSURef_96_SILVA_04_10_08_opt.arb du projet SILVA (Pruesse et al., 2007). Guo et al.
(2008b) ont utilisé des amorces pour quantifier les Firmicutes. Les amorces définies dans
notre travail sont plus spécifiques que celles utilisées par Guo et al. (78% vs 71% des
séquences ciblées et 4% vs 15% des séquences non ciblées). Ainsi notre système de détection
des Firmicutes est plus spécifique que ceux précédemment décrits.
Layton et al. (2006) ont utilisé des amorces et des sondes pour quantifier les
Bacteroides Prevotella. Bien que le pourcentage d’hybridation de nos amorces Bacteroides
Prevotella soit inférieur pour le groupe ciblé (92% vs 97% soit 718 séquences), nous avons
toutefois nettement amélioré le pourcentage d’hybridation non spécifique (0% contre 3% soit
7058 séquences). De plus, la température d’hybridation de nos amorces Bacteroides
285
Discussion générale
Prevotella est très proche (59.5°C et 60.1°C) de celle recommandée (60°C) pour l’utilisation
du TaqMan® universal PCR master mix (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey,
USA). En conséquence, notre système de détection des Bacteroides Prevotella reste
spécifique et surtout parfaitement en adéquation avec la température d’hybridation conseillée.
En résumé, afin de mieux caractériser les communautés bactériennes des
fermenteurs digestifs, nous avons utilisé des techniques de qPCR sur les divisions
bactériennes qui y sont majoritairement présentes (Firmicutes et les Bacteroides
Prevotella). La qPCR permet de rendre compte de l’aspect quantitatif des communautés
étudiées contrairement à la CE-SSCP qui nous donne une représentation qualitative et
semi-quantitative du microbiote. Les informations fournies par les deux techniques sont
donc parfaitement complémentaires et permettent de mieux caractériser le microbiote.
Les méthodes de détection que nous avons mises au point sont plus spécifiques pour les
Firmicutes et les Bacteroides Prevotella que les méthodes précédemment décrites.
2
2
Les deux modèles retenus dans le cadre de notre travail, la vache et le lapin, ont été
choisis car la physiologie digestive de leurs fermenteurs est représentative des deux
principales stratégies évolutives rencontrées chez les mammifères herbivores. Chez la vache,
le rumen est de grande taille, compartimenté et situé en amont du tube digestif. En revanche,
chez le lapin le cæcum est de petite taille, non-compartimenté et situé en fin de tube digestif.
Une approche comparée de deux modèles aussi différents permet de mieux
appréhender le fonctionnement global des fermenteurs digestifs. En effet, aussi différents
soient ils, un des principaux services rendus par le fermenteur digestif de la vache et du lapin
est la dégradation des composés peu digestibles (fibres) pour les rendre accessibles à l’hôte.
L’approche comparée permet de décrire les caractéristiques communes des communautés
microbiennes partagées par les fermenteurs digestifs étudiés mais aussi les particularités
propres à chaque fermenteur. L’objectif de ce travail était de caractériser les communautés
procaryotiques des fermenteurs digestifs des herbivores en termes de richesse, de diversité, de
structure et de composition des communautés procaryotiques.
Ce travail a également apporté des éléments de réponse sur la caractérisation des
écosystèmes digestifs étudiés en l’absence ou en présence d’une perturbation induite.
286
Discussion générale
2
5
A
B
Diversité de
Simpson
Richesse
30
7
25
Expérience 2
2
5
Expérience 2
3
10
Expérience 1
4
Expérience 2
5
Expérience 1
15
Expérience 1
20
Expérience 2
Expérience 1
6
1
0
vache
lapin
Bactéries
vache lapin
Archaea
0
vache
lapin
Bactéries
C
Quantité en log
copy par g-1
12
10
8
6
4
2
0
vache lapin vache lapin vache lapin
Bactéries
Firmicutes Bacteroides
Prevotella
Figure 47. Comparaison des communautés procaryotiques du rumen de la vache et du cæcum de
lapin pour les bactéries et les Archaea en terme de richesse (A), de diversité de Simpson (B) et de
densités de Bactéries, de Firmicutes et de Bacteroides Prevotella (C).
La richesse est exprimée en nombre de pics au sein des profils CE-SSCP et correspond donc au
nombre d’espèces majoritaires
287
Discussion générale
En estimant le nombre moyen de copies du gène 16S par cellule à 2.9 (Acinas et al.,
2004), la communauté bactérienne du rumen, en conditions normales (e.g. individu adulte,
avec un régime standard, sans perturbation induite) est composée en moyenne de 2.0×1011
bactéries ml-1, 6.3×108 Firmicutes ml-1, et 5.7×108 Bacteroides Prevotella ml-1 pour une
diversité moyenne de Simpson de 6.2 ± 0.8 (Etude expérimentale – Chapitre 3). La
communauté bactérienne du cæcum du lapin, en conditions normales, est composée en
moyenne de 1.3×1012 bactéries ml-1, 2.1×108 Firmicutes ml-1, et 4.6×107 Bacteroides
Prevotella ml-1 pour une diversité moyenne de Simpson de 5.6 ± 0.8. Ainsi, d’un point de vue
quantitatif, les communautés procaryotiques diffèrent donc entre ces deux fermenteurs
digestifs. Les communautés de bactéries et d’Archaea du rumen sont plus riches (+8 % de
pics pour les bactéries, +12 % pour les Archaea ; Figure 47A) que celles du cæcum et pour les
bactéries plus diverses (+19 % pour l’indice de Simpson ; Figure 47B). Ces différences de
richesse et de diversité de Simspon sont confirmées par l’observation des profils CE-SSCP
moyens qui sont plus saturés chez la vache que chez le lapin (Figure 48). Le microbiote du
rumen de la vache contient également une proportion moindre de bactéries (-4.9 %) mais
davantage de Firmicutes (+8 %) et de Bacteroides Prevotella (+15 %) que le cæcum du lapin
(Figure 47C). De plus, les structures des communautés de bactérie (Figure 49A) et d’Archaea
(Figure 49B) différent entre le rumen et le cæcum.
A rumen de la vache
B cæcum du lapin
Figure 48. Comparaison des profils CE-SSCP moyens du rumen de la vache (A) et du cæcum du
lapin (B).
D’après les études expérimentales du chapitre 3
288
Discussion générale
A Bactérie
B Archaea
lapin
expérience 2
vache
expérience 1
vache
vache
expérience 2
lapin
lapin
expérience 1
Figure 49. Comparaison de la structure de la communauté de bactérie en fonction des essais (A)
et d’Archaea (B, essais 1 et 2) dans le rumen de la vache et le cæcum du lapin par nMDS.
La comparaison des profils CE-SSCP a été réalisée avec les distances euclidiennes et avec le
coefficient de Dice-Sørensen respectivement pour les bactéries et les Archaea.
Les spécificités des communautés de bactéries et d’Archaea pour chacune des deux
espèces de mammifères herbivores étudiées peut être expliquées par des différences
d’environnements dans lesquels évoluent les populations. En effet, dans nos conditions
expérimentales, le contenu ruminal de la vache est moins acide (pH=6.67 ± 0.11 pour le
rumen et pH=6.10 ± 0.29 pour le cæcum) et plus réducteur (Eh=-222 ± 17 mV pour le rumen
et Eh=-192 ± 26 mV pour le cæcum) et contient moins d’AGV (77.0 ± 15.6 mM pour le
rumen et 94.7 ± 16.6 mM pour le cæcum) et plus de NH3-N (8.3 ± 2.5 mM pour le rumen et
6.0 ± 3.3 mM pour le cæcum) que le contenu du cæcum de lapin (Etude expérimentale –
Chapitre 3). Ces paramètres environnementaux sélectionnent probablement les espèces de
micro-organismes en fonction de leurs contraintes écologiques spécifiques (Ley et al., 2006).
Une autre hypothèse pour expliquer la spécificité espèce hôte/microbiote pourrait être une
coévolution spécifique entre chaque espèce hôte et son microbiote. Ainsi, la plus grande
diversité et la plus grande richesse observée dans le rumen par rapport au cæcum pourrait être
attribuée à la plus grande hétérogénéité des substrats entrant dans le rumen et donc du contenu
ruminal en comparaison des substrats entrant dans le cæcum et du contenu cæcal. En effet,
l’hétérogénéité est source d’une importante diversité de conditions environnementales qui
fournit une grande variété de micro-niches différentes favorables à l’apparition d’espèces
différentes, spécifiques à chaque micro-niche (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008a). Cette
289
Discussion générale
relation entre hétérogénéité environnementale et diversité biologique est classiquement
observé en macro-écologie et semble également avoir lieu dans certains écosystèmes
microbiens comme dans les sédiments de marais salants (Horner-Devine et al., 2004).
La spécificité espèce hôte/microbiote que nous observons ne peut toutefois pas se
généraliser aux autres espèces de mammifères. En effet, étant donné que nous avons choisi
des modèles biologiques les plus différents possibles quant à leur physiologie et leur anatomie
digestive, il est possible que chez deux espèces de mammifères plus proches, cette specificité
ne soit pas vérifiée. Des études comparatives complémentaires sur animaux plus proches
permettraient de mieux définir l’importance de l’anatomie digestive, de la physiologie
digestive, des conditions environnementales et des phénomènes potentiels de coévolution
dans la sélection des espèces procaryotiques au sein des écosystèmes digestifs.
En résumé, les communautés procaryotiques des fermenteurs digestifs sont
spécifiques à chaque modèle étudié : la vache et le lapin. Les communautés du rumen
sont plus riches (bactéries et Archaea), plus diverses (bactéries) et abritent des densités
en Firmicutes et en Bacteroides Prevotella plus importantes que celles du cæcum du
lapin. En revanche, la densité totale de bactéries est plus importante dans le cæcum du
lapin que dans le rumen de la vache.
2
2
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Etant donné que les communautés bactériennes des fermenteurs digestifs abritent
plusieurs centaines d’espèces, il est probable que les espèces présentes et leurs abondances
respectives diffèrent d’un individu à l’autre. De tels résultats ont été mis en évidence chez la
vache au niveau du côlon (Dowd et al., 2008), chez l’Homme (Abell et al., 2008 ; Abell &
McOrist, 2007; Green et al., 2006 ; Zoetendal et al., 1998 ) et chez le chien (Simpson et al.,
2002). En revanche, une étude menée dans le cæcum de la caille n’a pas permis de mettre en
évidence de différences entre individus (Scupham, 2007). Dans le rumen du mouton, les
données de la bibliographie apportent des résultats contradictoires. Ainsi, au cours d’une
étude portant sur l’alimentation, Sadet et al. (2007) ont démontré par classification
hiérarchique des profils DGGE que les communautés bactériennes se regroupent d’abord en
fonction du régime alimentaire et dans une moindre mesure en fonction de la fraction
ruminale (liquide, solide) mais ne se regroupent pas en fonction de l’individu. A l’inverse,
Edwards (2005) a montré sur le même modèle (rumen du mouton) que les communautés
290
Discussion générale
bactériennes se regroupent d’abord par individu et non pas par l’effet d’un traitement
antibiotique. Ces exemples illustrent la difficulté de mettre en évidence l’effet « individu
hôte ». Nous formulons l’hypothèse que cette difficulté trouve deux origines. D’une part,
l’étude d’un facteur de variation nécessite une répétition de l’échantillonnage. En
conséquence, pour tester si l’écosystème digestif d’un individu héberge une communauté qui
lui est propre, il faut échantillonner les mêmes individus soit à différents intervalles de temps,
soit à différentes zones de prélèvements à un instant donné. Dans les deux cas, il existe une
confusion partielle de l’effet « individu hôte » et de l’effet du temps ou de la zone
d’échantillonnage. En conséquence, si l’effet « individu hôte » est significatif cela signifie que
les communautés bactériennes présentent un patron commun qui se maintient soit dans le
temps soit dans l’espace et ce indépendamment de la possible variabilité induite par l’effet
temps ou espace. D’autre part, lorsque l’on cumule l’étude de la variabilité individuelle avec
celui d’un ou plusieurs autres facteurs de variation, les résultats concernant l’effet « individu
hôte » peuvent dépendre des autres effets étudiés. Or, les outils statistiques multivariés
(ordinations, classification hiérarchique, tests basés sur une hypothèse) font ressortir en
priorité les facteurs qui induisent le plus de variabilité etne permettent pas de tester
efficacement les interactions. C’est pourquoi, l’effet « individu hôte » sur la variabilité des
communautés bactériennes peut apporter des résultats contradictoires en fonction de
l’ampleur de l’effet des autres facteurs de variation étudiés au même moment.
A notre connaissance, avant nos travaux, aucune étude ne s’est intéressée à étudier la
variabilité individuelle des communautés bactériennes du cæcum chez le lapin et du rumen
chez la vache. Nos résultats n’ont pas permis de mettre en évidence de différences de
communautés bactériennes entre les individus dans ces deux fermenteurs digestifs (richesse,
diversité, structure, densité de bactérie, de Firmicutes et de Bacteroides Prevotella). En plus
des considérations précédemment évoqués, nous formulons l’hypothèse qu’une absence de
variabilité individuelle peut également s’expliquer par le fait que dans nos études les animaux
sont suffisamment proches, génétiquement et environnementalement, pour contraindre les
communautés bactériennes de la même façon. En effet, les animaux que nous avons utilisé
sont issus de lignées sélectionnées depuis plusieurs générations (néozélandais x californien
pour le lapin, Prim’ Holstein pour la vache) ce qui entraine une forte similarité génétique
entre les individus (notion de race). De plus, l’élevage en conditions contrôlées (alimentation,
logement, paramètres d’ambiance) tend à uniformiser les espèces présentes dans
l’environnement qui peuvent coloniser le tractus digestif et le développement des hôtes
291
Discussion générale
réduisant ainsi leur influence sur la communauté bactérienne qu’ils hébergent. A l’opposé, il a
été montré que l’importante variabilité des communautés bactériennes entre individus chez
l’Homme peut être due aux habitudes alimentaires spécifiques à chaque individu (Flint et al.,
2007).
2
2
' *
Nos résultats démontrent que les communautés d’Archaea (richesse, structure) sont
similaires entre individus au sein d’une même espèce : vache ou lapin. Des études, in vivo et
in vitro
sur l’émission de méthane des lapins adultes montrent que certains individus
produisent une forte quantité de méthane alors que d’autres en produisent de faibles quantités
(Belenguer et al., 2008; Marounek et al., 1999; Piattoni et al., 1996). Chez l’homme, une
situation similaire est observée avec des individus dits « producteurs » de méthane (>108
cellules ml-1) et des individus dits « non producteurs » (102 à 103 cellules ml-1 ; Doré et al.,
1995; El Oufir et al., 1996; Pochart et al., 1993). Ces résultats suggèrent que les individus non
producteurs de méthane hébergent des communautés d’Archaea différentes et qu’une voie
métabolique d’hydrogénotrophie est utilisée préférentiellement. Ainsi, l’acétogenèse
réductrice a été mise en évidence chez les rongeurs (Prins & Lankhorst, 1977). Chez
l’Homme et chez le rat cette variabilité dans la composition de la communauté d’Archaea
semble davantage être due à des facteurs environnementaux et alimentaires qu’au génome de
l’hôte (Florin et al., 2000). De façon similaire, dans nos études, les animaux au sein d’une
même espèce (vache ou lapin) partagent le même environnement (conditions de détention et
d’élevage), et la même alimentation. De ce fait, si les observations de Florin et al. (2000) se
vérifient chez la vache et le lapin, l’absence de spécificité des individus au sein d’une même
espèce peut s’expliquer par cette homogénéité de l’environnement et de l’alimentation.
En résumé, au sein d’une même espèce hôte, l’existence d’une variabilité dans la
composition de leur microbiote digestif entre individus hôtes est probable en raison du
nombre d’espèces hébergées. Toutefois cette variabilité est peu aisée à mettre en
évidence et son ampleur reste assez méconnue. Ainsi, en l’état actuel, nos travaux n’ont
pas démontré chez la vache et chez le lapin, l’existence d’un patron spécifique à chaque
individu qui se maintiendrait dans le temps et dont l’effet serait aussi important ou plus
important que d’autres effets induits. Nous suggérons que la similarité génétique entre
des animaux issus de lignées sélectionnées et la forte standardisation des paramètres
292
Discussion générale
d’élevage de ces animaux tendent à uniformiser l’influence de l’hôte sur la composition
de sa communauté bactérienne.
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2
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Nous avons comparé les communautés procaryotiques présentes à différents sites du
tube digestif chez la vache et chez le lapin. Chez la vache, nous avons comparé les
communautés du rumen, du réticulum et des fèces (comme représentant du contenu colique).
Chez le lapin, nous avons comparé les communautés procaryotiques présentes dans le contenu
cæcal, les cæcotrophes et les crottes dures (comme représentant du contenu colique). Nos
résultats montrent que les communautés procaryotiques sont spécifiques de chaque
compartiment au sein du tube digestif, que ce soit chez la vache ou chez le lapin. Cette
spécificité semble également se vérifier chez d’autres mammifères comme chez le mouton
(Lin et al., 1997), la chèvre (Lin et al., 1997), le porc (Lin et al., 1997 ; Simpson et al., 1999)
et l’Homme (Marteau et al., 2001; Zoetendal et al., 2002b). Mais nos résultats montrent
également que la proximité spatiale ou physiologique des sites de prélèvement entraine une
proximité dans les communautés qu’ils hébergent. Ainsi, chez la vache, la communauté de
bactéries (Figure 50A et Figure 47B) et d’Archaea (Figure 50C) du rumen et des feces ont des
structures différentes. A l’inverse, dans le réticulo-rumen, que le prélèvement soit réalisé en
partie ventrale ou dorsale du rumen ou dans le réticulum, les communautés microbiennes sont
similaires (Figure 51A). Chez le lapin, la richesse des communautés de bactéries et
d’Archaea, la diversité bactérienne (non montré) et la structure des communautés d’Archaea
(Figure 47C) du contenu cæcal, des cæcotrophes et des crottes dures sont similaires mais la
structure des communautés bactériennes diffère légèrement. De plus, si la structure des
communautés bactériennes diffèrent entre les trois types d’échantillons, celles du cæcum et
des cæcotrophes sont plus proches entre elles que celles des crottes dures (Figure 52A et
Figure 47B). Le cæcum est en effet situé en position distale du tube digestif et est adjacent au
côlon d’où proviennent les crottes dures (De Blas & Wiseman, 1998) tandis que les
cæcotrophes correspondent à du contenu cæcal couvert d’une couche de mucus qui a transité
dans le colon avant excrétion (Carabaño & Piquer, 1998).
La physiologie des divers organes digestifs et la composition chimique de leur contenu
peut expliquer ces situations. Ainsi, le pH, le degré d’anaérobiose et la composition du
substrat entrant dans le rumen et le côlon de la vache varient de façon importante. Cette
293
Discussion générale
variabilité physico-chimique et de composition engendrent des conditions environnementales
différentes qui peuvent en partie expliquer les différences de structures observées. Plusieurs
auteurs (Miller, 1995; Minato et al., 1992; Morvan et al., 1996) démontrent que le nombre
d’Archaea est lié à celui des organismes cellulolytiques et donc à la proportion de fibres dans
le fermenteur. Or 50 à 80 % de la fibrolyse à lieu dans le rumen. Par conséquent, une
proportion de fibres moins importante dans les feces que dans le rumen (Fonty &
Chaucheyras-Durand, 2008c) pourrait expliquer la moindre richesse en Archaea dans les
feces que dans le rumen.
A Communauté bactérienne chez la
vache
C Communauté d’Archaea chez la
vache
rumen
rumen
feces
feces
B Communauté bactérienne chez la vache: profils CE-SSCP moyens
rumen
feces
Figure 50. Comparaison de la structure des communautés de bactéries (A) et d’Archaea (C)
entre le rumen et les feces de la vache. Comparaison des profils CE-SSCP moyens du rumen et
des feces (B).
Chez le lapin, la composition chimique des cæcotrophes est proche de celle du contenu
cæcal mais diffère de celle des crottes dures. Ainsi, les cæcotrophes contiennent plus de
protéines (300 et 170 g kg-1 de matière sèche respectivement pour les cæcotrophes et les
crottes dures) tandis que les crottes dures comportent plus de fibres (180 et 300 g kg-1 de
matière sèche respectivement pour les cæcotrophe et les crottes dures ; Carabaño et al., 1988;
294
Discussion générale
Fraga et al., 1991). Ces différences de compositions engendrent des conditions
environnementales différentes et pourraient donc être à l’origine des différences observées sur
les communautés.
295
Discussion générale
A Communauté bactérienne dans
différentes zones du rumen de la vache
B Communauté bactérienne entre deux
fraction du sac ventral du rumen de la vache
sac dorsal
réticulum
sac ventral
fraction
solide
fraction
liquide
C Communauté bactérienne chez la vache: profils CE-SSCP moyens en
fonction des fractions du rumen ventral
Fraction solide
Fraction liquide
Figure 51. Comparaison de la structure des communautés bactériennes entre les compartiments
du rumen (A) et entre les fractions (liquide, solide) au sein du sac ventral du rumen (B).
Comparaison des profils CE-SSCP moyens de la fraction solide et de la fraction liquide au sein
du sac ventral du rumen (C).
296
Discussion générale
A Communauté bactérienne chez le
lapin
C Communauté d’Archaea chez le
lapin
cæcotrophes
cæcotrophes
crottes
dures
cæcum
crottes dures
cæcum
B Communauté bactérienne chez le lapin: profils CE-SSCP moyens
cæcum
cæcotrophes
crottes dures
Figure 52. Comparaison de la structure des communautés de bactéries (A) et d’Archaea (C)
entre le cæcum, les cæcotrophes et les crottes dures du lapin. Comparaison des profils CE-SSCP
moyens du cæcum, des cæcotrophes et des crottes dures (B).
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2
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Chez le lapin, le contenu cæcal forme une pate homogène. Une différentiation des
fractions liquide ou solide n’est donc pas pertinente. C’est la raison pour laquelle, cette notion
n’a été abordée que pour le rumen de la vache. La structure des communautés bactériennes
des fractions solides et liquides de la zone ventrale du rumen sont différentes (Figure 51B et
Figure 51C). La fraction solide abrite une communauté bactérienne plus riche (Figure 53A) et
plus diverse (Figure 53B) que la fraction liquide. De plus, la fraction solide du rumen contient
une densité plus importante de bactéries, de Firmicutes et de Bacteroides Prevotella que la
fraction liquide (Figure 53C). Ces différences ont déjà été observées dans le rumen de la
vache (Cho et al., 2006; Tajima et al., 1999), dans le rumen du mouton (Larue et al., 2005;
Tajima et al., 1999) et dans le côlon de l’Homme (Walker et al., 2008). Les bactéries de la
297
Discussion générale
fraction solide du rumen sont en contact avec un substrat hétérogène qui fournie aux bactéries
de nombreuses conditions environnementales à l’échelle microscopique. Cette plus grande
variété de micro-niches pour la fraction solide du rumen en comparaison avec la fraction
liquide permettrait la colonisation d’un plus grand nombre d’espèces en accord avec nos
résultats. Cette relation entre l’hétérogénéité des habitats d’un écosystème et la diversité
spécifique a déjà été observée chez les microorganismes colonisant les sédiments des marais
salants (Horner-Devine et al., 2004).
C
B
Richesse
Diversité de
Simpson
Bactéries
Firmicutes
Bacteroides
Prevotella
(log copie
(log copie
d’ADN 16S g-1) d’ADN 16S g-1) (log copie
d’ADN 16S g-1)
solide
liquide
solide
liquide
solide
liquide
8
6
4
solide
liquide
4
3
solide
liquide
2
0
2
1
0
0
5
10
15
20
5
25
6
10
30
7
12
35
A
Figure 53. Comparaison de la richesse bactérienne (A), de la diversité de Simpson (B) et des
densités de bactéries, Firmicutes et Bacteroides Prevotella (C) entre la fraction liquide et solide
du contenu ruminal du sac ventral.
La richesse est exprimée en nombre de pics au sein des profils CE-SSCP et correspond donc au
nombre d’espèces majoritaires
En résumé, les différents compartiments du tube digestif abritent des
communautés de bactéries et d’Archaea qui sont d’autant plus distinctes qu’ils sont
distants et qu’ils présentent une physiologie différente et un contenu de composition
différente. De plus, au sein du rumen, la communauté présente dans la fraction solide
apparait plus riche et plus diverse que celle présente de façon planctonique dans la
fraction liquide. D’un point de vue pratique, notre travail démontre que les cæcotrophes
peuvent être utilisées comme matrice alternative d’échantillonnage du contenu cæcal.
Cette alternative permettra de collecter des échantillons, à moindre coût, sans
298
Discussion générale
perturbation des animaux, et de réaliser ainsi un suivi dynamique des communautés
pour un même individu.
2
2
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Dans ce travail nous avons étudié les évolutions temporelles chez les communautés
procaryotiques des fermenteurs digestifs, en absence de perturbations induites, et pour des
écosystèmes en état climacique (animaux pré pubères pour le lapin ou pubères pour la vache).
Nos résultats montrent que la position du fermenteur sur le tube digestif semble influencer sa
dynamique naturelle. Ainsi, dans l’écosystème ruminal de la vache, situé en amont du tube
digestif, toutes les caractéristiques bactériennes étudiées (richesse, diversité, structure,
quantification des bactéries, des Firmicutes et des Bacteroides Prevotella) fluctuent de
manière sporadique et imprévisible mais significative entre les semaines successives de
prélèvement (Figure 40). Toutefois, ces oscillations autour d’un état sont de faibles
amplitudes en comparaison des évolutions observées suite à une perturbation induite
(nutritionnelle dans notre cas). En revanche, les communautés bactériennes du rumen
(diversité et structure) restent stables au cours d’une journée jusqu’à 6 heures post-prandiales.
A l’inverse, dans le cæcum qui est situé en aval du tube digestif, la communauté bactérienne
(diversité, structure, quantification des bactéries, des Firmicutes et des Bacteroides
Prevotella) reste stable dans le temps (Figure 43). Une telle stabilité a déjà été observée chez
d’autres mammifères: l’Homme (Abell et al., 2008; Abell & McOrist, 2007; Zoetendal et al.,
1998), le porc (Leser et al., 2000) et le chien (Simpson et al., 2002). Ces mammifères
possèdent, comme le lapin, un fermenteur situé position distale du tractus. Toutes ces données
suggèrent qu’en l’absence de perturbation, la communauté bactérienne du cæcum est en état
d’équilibre stable alors que celle du rumen est en état d’équilibre dynamique (Tuljapurkar &
Semura, 1977). Un état d’équilibre dynamique est classiquement observé dans d’autres
écosystèmes microbiens (Chave et al., ; Fernandez et al., 1999; Gardner et al., 2007 ;
Wingreen & Levin, 2006) mais n’a pas été observé chez le mouton par DGGE dont le rumen
est également en situation proximale (Edwards et al., 2005). Il a été montré qu’un tel état
n’engendre pas forcément d’évolution dans les fonctionnalités de l’écosystème (Fernandez et
al., 1999).
Nos données suggèrent que la stabilité d’un écosystème serait favorisée lorsque le flux
et la composition des nutriments entrant dans le fermenteur est plus constante, comme dans le
299
Discussion générale
cas du cæcum du lapin. A l’opposé, les communautés seraient plutôt en équilibre dynamique
lorsque le flux et la composition des nutriments ainsi que les conditions environnementales
(température, dioxygène) sont plus variables. Ainsi, chez la vache, l’ingestion alimentaire
entraine une entrée brusque de matières premières végétales et de dioxygène qui sont à une
température plus faible que la température de l’écosystème et de l’hôte. Toutefois, l’absence
d’évolution post-prandiale ne corrobore pas cette explication. D’autres études sont nécessaires
pour vérifier la validité de cette hypothèse et permettraient ainsi une meilleure compréhension
du fonctionnement des fermenteurs digestifs des mammifères.
Les communautés d’Archaea présentent des comportements différents puisqu’elles
semblent être stables dans les deux fermenteurs étudiés (rumen et cæcum). Des résultats
similaires ont été observés chez l’Homme et le rat (Florin et al., 2000). Cette absence
d’évolution temporelle peut être expliquée par la faible richesse des communautés d’Archaea
dans les systèmes digestifs, qui par conséquent ne peuvent pas faire de ‘ré-ajustements’
permanents de leurs microbiotes par redondance fonctionnelle (Cardinale et al., 2002). Elle
peut également être expliquée par nos choix méthodologiques (nested PCR puis analyse en
mode binaire) qui rendent les analyses plus grossières et les différences subtiles plus difficiles
à mettre en évidence.
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2
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Nous avons étudié la dynamique des communautés bactériennes suite à une
perturbation ponctuelle (prélèvement par voie chirurgicale dans le cæcum du lapin) ou
maintenue dans le temps (augmentation du ratio amidon/fibres dans l’alimentation de la vache
et du lapin). Ces deux types de perturbations (ponctuelle ou maintenue) apportent des
réponses différentes sur le fonctionnement des écosystèmes. Ainsi, une perturbation
ponctuelle permet d’apporter des réponses sur les capacités de résilience d’un écosystème et
d’appréhender son seuil d’irréversibilité. D’un point de vue écologique, la résilience exprime
l'aptitude d'un écosystème à retrouver sont état initial plus ou moins vite après une
perturbation tandis que le seuil d’irréversibilité caractérise une perturbation dont l’amplitude
dépasse la capacité de résilience de l’écosystème (Fonty & Chaucheyras-Durand, 2008a; Ives
& Carpenter, 2007). En complément, les perturbations qui sont maintenues dans le temps
permettent d’apprécier la réactivité et le temps d’adaptation nécessaire à un écosystème pour
faire face aux nouvelles conditions qui lui sont imposées ou permettent au contraire
300
Discussion générale
d’apprécier son pouvoir de résistance à une perturbation (Fonty & Chaucheyras-Durand,
2008a; Ives & Carpenter, 2007).
A
B
avant opération chirurgicale
après opération chirurgicale
après opération
chirurgicale
avant opération
chirurgicale
Figure 54. Effet de la perturbation induite par l’opération chirurgicale sur la structure de la
communauté bactérienne du cæcum du lapin (A). Comparaison des profils CE-SSCP moyens
des communautés bactériennes du cæcum avant et après la perturbation (B).
L’acte chirurgical que nous avons pratiqué sur le cæcum du lapin entraine i) une entrée
de dioxygène dans le fermenteur qui fonctionne normalement en conditions anaérobiques
(Kimsé et al., 2008) et ii) une réponse inflamatoire locale qui peut influencer le microbiote à
proximité de l’épithélium. Nos données montrent que les communautés bactériennes
(structure, diversité et richesse) sont fortement perturbées une semaine après l’intervention
chirurgicale et restent stables autour de cet état de perturbation jusqu’à la fin de l’étude, soit 2
semaines après la perturbation (Figure 33 ; Figure 54). Ce résultat suggère que la perturbation
appliquée a eu une amplitude qui est proche du seuil d’irréversibilité du système. Des mesures
réalisées quelques mois après cette perturbation permettraient de valider cette hypothèse. Pour
l’étude de l’écosystème ruminal, toutes les données de notre travail proviennent de vaches
porteuses de canules au niveau du rumen. Ces canules ont été posées plusieurs mois avant le
début de nos essais et les réactions inflammatoires éventuelles avaient disparues au moment
de nos prélèvements. L’utilisation de canule ruminale pour des raisons expérimentales est très
répandue et aucune donnée ne permet de soupçonner une influence néfaste de cette pratique
sur l’activité fermentaire des communautés microbiennes. De ce point de vue, les
communautés bactériennes du rumen semblent plus robustes que celles du cæcum des lapins.
Cette différence peut être reliée au positionnement proximal du rumen sur le tractus digestif
qui s’accompagne d’entrée de dioxygène au moment de l’ingestion, à l’opposé du cæcum
dans lequel n’entre pas de dioxygène ambiant. Toutefois, comme nous l’avons suggéré cette
301
Discussion générale
situation explique également probablement la différence fontionnelle entre les deux
écosystèmes (équilibre dynamique vs équilibre stable).
La réponse des écosystèmes bactériens du rumen et du cæcum à une augmentation
continue du ratio amidon/fibres dans l’alimentation de l’individu hôte appliquée de façon
continue présente des similarités et des différences. Dans les deux cas, une modification des
communautés bactériennes est observée en réponse à la perturbation. Cette modification
apparait très rapidement après le début de la perturbation et se maintient tout au long de la
perturbation. Ainsi, dans le rumen, toutes les mesures réalisées sur le microbiote (richesse,
diversité, structure, quantification des bactéries, des Firmicutes et des Bacteroides Prevotella)
ont diminuées, parfois faiblement mais toujours significativement (Figure 40). Dans le
cæcum, la perturbation que nous avons appliquée a également engendré des modifications de
la communauté bactérienne (structure, quantification des bactéries, des Firmicutes et des
Bacteroides Prevotella) dès le deuxième jour après la perturbation et ces modifications se sont
maintenues durant les 39 jours d’observation (Figure 43). En revanche, l’indice de diversité
est resté stable dans le temps (Figure 43). Pendant la perturbation, les vaches n’étaient pas en
situation d’acidose et la mortalité des lapins n’était pas supérieure à celle des animaux
témoins. Ces résultats suggèrent que la perturbation appliquée était d’ampleur modérée et que
les communautés bactériennes du rumen et du cæcum se sont adaptées très rapidement à cette
perturbation d’ampleur modérée. Toutefois, les communautés bactériennes du rumen et du
cæcum présentent aussi des différences dans leurs réponses à cette perturbation. Ainsi, chez la
vache, pendant la période de perturbation, nous observons dans la communauté bactérienne
ruminale des fluctuations sporadiques, dont la succession, l’ampleur et la fréquence ne
permettent pas d’identifier une tendance évolutive particulière. En revanche, chez le lapin, la
communauté bactérienne cæcale atteint après la perturbation un nouveau état de stabilité qui
ne varie pas pendant le reste de la période de perturbation. Cette situation est probablement à
rapprocher des observations précédemment réalisées pour ces deux écosystèmes en conditions
non perturbées. Même en situation perturbée, l’écosystème ruminal semble se caractériser par
un équilibre dynamique tandis que dans le cæcum les communautés bactériennes semblent
être dans un équilibre statique.
En résumé, nos travaux démontrent que, chez des animaux adultes, la
communauté bactérienne du fermenteur digestif de la vache (rumen) fluctue
ponctuellement dans le temps selon un état d’équilibre dynamique alors que celle du
fermenteur digestif du lapin (cæcum) reste stable dans le temps (état d’équilibre
302
Discussion générale
statique). Ces données peuvent être réliées à la position des fermenteurs sur le tube
digestif qui sont soumis à des conditions et des flux de nutriments plus variables en
situation proximale qu’en situation distale. La réponse de ces fermenteurs à une
perturbation nutritionnelle maintenue dans le temps démontre leur capacité
d’adaptation et confirme leurs différences de fonctionnement (statique ou dynamique)
observées en conditions non perturbées. Il est à noter que bien que l’équilibre de la
communauté bactérienne du cæcum est statique, celle-ci présente une capacité à
s’adapter rapidement lors d’une perturbation.
4
D’une façon générale, nos études n’ont pas permis de mettre en avant des corrélations
importantes entre les caractéristiques de la communauté bactérienne (richesse, diversité,
structure, quantité de Bactéries, de Firmicutes et de Bacteroides Prevotella) et les paramètres
environnementaux (pH, potentiel d’oxydoréduction, concentrations en acides gras volatils,
concentration en NH3-N, concentration en fibres alimentaires). Ces faibles corrélations ont été
observées à la fois chez la vache et chez le lapin que ce soit en conditions perturbées ou non.
Toutefois, dans le rumen de la vache, lors de nos deux expériences nous avons mis en
évidence une corrélation significative avec la concentration en NH3-N. Le pouvoir réducteur
(mesuré par le potentiel redox) et le pH sont des paramètres physico-chimiques connus pour
sélectionner les espèces bactériennes dans les fermenteurs digestifs des animaux (Kamra,
2005). Etonnement dans nos études nous n’avons pas établi de relations directes avec ces
paramètres que ce soit en absence de perturbation ou sous contrainte d’une perturbation. Cette
absence de corrélation pourrait être attribuée aux faibles changements de ces paramètres en
réponse à la perturbation. Dans des études ultérieures, il serait intéressant d’appliquer des
perturbations nutritionnelles plus conséquentes pour induire des changements importants des
paramètres du milieu afin d’essayer de mettre en évidence des relations entre ces paramètres
et la modification du microbiote.
En résumé, nous n’avons pas pu établir de fortes corrélations entre les
caractéristiques des communautés bactériennes et les paramètres environnementaux
mesurés. Toutefois, il semble que la concentration en NH3-N soit toujours corrélée, mais
faiblement, aux communautés bactériennes du rumen de la vache. Des perturbations
plus importantes affectant de façon plus conséquente l’écosystème digestif permettraient
303
Discussion générale
sans doute de progresser dans la connaissance des relations entre le microbiote et son
biotope.
304
N
305
306
Conclusions & Perspectives
Nous avions pour objectif de contribuer à une meilleure connaissance de l’écologie
des communautés procaryotiques des fermenteurs digestifs des mammifères herbivores. Nous
nous sommes intéressés à caractériser la variabilité taxonomique (entre espèces animales),
individuelle, spatiale (inter- et intra- fermenteurs digestifs) et temporelle (dynamique
journalière et hebdomadaire avec ou sans perturbation induite, dynamique post-prandiale) des
communautés procaryotiques et à établir le lien entre ces communautés et leur environnement.
L’originalité de nos travaux a consisté à comparer les communautés procaryotiques de deux
modèles animaux, la vache et le lapin, dont les physiologies digestives sont très différentes et
représentatives des deux principales stratégies évolutives rencontrées chez les mammifères
herbivores actuels. Cette approche présente l’avantage de contribuer à identifier les
caractéristiques écologiques des communautés procaryotiques qui sont communes à tous les
fermenteurs digestifs et celles qui sont spécifiques à chaque stratégie évolutive.
D’un point de vue méthodologique, les communautés procaryotiques ont été
caractérisées sur les gènes codant pour l’ARNr 16S en termes de diversité et de structure par
CE-SSCP et en termes de densités en Bactéries totales, en Firmicutes et en Bacteroides
Prevotella par la mise au point de systèmes de détection qPCR plus spécifiques que ceux
précédemment décrits. Nous avons élaboré et utilisé de nouveaux
algorithmes
bioinformatiques et biostatistiques pour traiter et analyser les profils CE-SSCP et mis à la
disposition de la communauté scientifique un logiciel libre de droits pour l’analyse des profils
d’empreintes moléculaires (programme StatFingerprints sous R). Ces nouveaux outils nous
ont permis de minimiser les artefacts de la CE-SCCP (décalage verticaux et horizontaux des
signaux, intensité différentielle, saturation), et d’extraire le maximum d’information
écologique contenue dans ces signaux (diversité, structure, espèces majoritaires, espèces
rares). En perspective, il semble intéressant de développer des algorithmes permettant de
supprimer de façon objective les pics artefacts au sein des profils. En effet, avec les
techniques actuelles l’utilisateur définit lui-même et de façon arbitraire un seuil au-dessous
duquel les pics sont considérés comme des artefacts. Une solution consisterait à définir un
seuil optimal pour chaque profil avant de les normaliser. Pour cela, des valeurs de seuil
propres à chaque profil peuvent être calculées en tenant compte de l’aire totale du profil
étudié. Dans nos travaux, nous avons obtenu des profils CE-SSCP très saturés pour l’analyse
des bactéries, c'est-à-dire avec un nombre modéré de pics et un bruit de fond important, car
les amorces utilisées ciblaient l’ensemble des espèces bactériennes. A l’avenir, il serait donc
intéressant d’affiner l’image qualitative que l’on a de la communauté bactérienne en
307
Conclusions & Perspectives
réalisant des analyses CE-SSCP pour cibler, non plus les bactéries totales, mais des sous
groupes taxonomiques bactériens renfermant moins d’espèces. L’information obtenue sur les
espèces sera ainsi plus précise d’un point de vue qualitatif mais aussi quantitatif. De plus, la
limite principale de la CE-SSCP reste l’impossibilité d’identifier les espèces correspondant
aux différents pics. En complément, des travaux de séquençage exhaustifs permis par les
nouvelles technologies ultra haut débit nous permettraient de compléter la caractérisation des
communautés étudiées.
D’un point de vue cognitif, nos travaux démontrent que, dans des conditions
normales, l’écosytème ruminal est composé de 2.0×1011 bactéries ml-1, 6.3×108 Firmicutes
ml-1, et 5.7×108 Bacteroides Prevotella ml-1 qui habitent dans un milieu acide (pH=6.67),
réducteur (Eh=-222 mV) contenant 77.0 mM d’AGV et 8.3 mM de NH3-N. L’écosytème
cæcal du lapin est composé en moyenne de 1.3×1012 bactéries ml-1, 2.1×108 Firmicutes ml-1,
et 4.6×107 Bacteroides Prevotella ml-1 qui habitent dans un milieu acide (pH=6.10), réducteur
(Eh=-192 mV) et qui contient en moyenne 94.7 mM d’AGV et 6.0 mM de NH3-N. Ces
résultats indiquent une spécificité espèce hôte/microbiote dans les deux modèles étudiés qui
suggére un rôle déterminant de la physiologie digestive de l’hôte et/ou des phénomènes de
coévolution hôte/microbiote. Comparer des modèles biologiques plus proches en termes de
physiologie digestive ou de taxonomie, deux espèces de ruminants ou deux espèces de
lagomorphes, permettrait de confirmer ces hypothèses. Nos travaux n’ont pas mis en évidence
de spécificité individuelle des communautés microbiennes digestives qui peut être expliquée
par la proximité génétique des individus utilisés et/ou la forte standardisation de leurs
conditions d’élevage. La comparaison des microbiotes chez des individus homozygotes (vrais
jumeaux) ou encore chez des individus appartenant à la même espèce mais à des races
différentes permettraient de mieux comprendre l’importance respective du génotype de l’hôte
et de son environnement dans le déterminisme de son microbiote.
Nos travaux montrent que les communautés microbiennes évoluent le long du
tractus digestif de sorte que plus les compartiments sont éloignés spatialement et
physiologiquement, plus leurs microbiotes sont différents. Nous avons également confirmé
une différence entre la communauté présente de façon planctonique dans la fraction liquide du
contenu ruminal et celle attachée ou associée aux particules alimentaires dans la fraction
solide. A l’état basal, la communauté bactérienne du rumen montre une fluctuation
continue qui suggère un état d’équilibre dynamique. En revanche, dans le cæcum et sans
perturbation, la communauté bactérienne semble en équilibre statique. Nous formulons
308
Conclusions & Perspectives
l’hypothèse que cette différence trouve son origine dans la situation du fermenteur sur le
tractus digestif. En situation proximale, le fermenteur est soumis au moment de l’ingestion à
des variations dans les paramètres du milieu (dioxygène, température) et dans les flux de
nutriments (vitesse d’entrée et nature) qui peuvent modifier le microbiote sans remettre en
cause sa fonction ni son équilibre. A l’opposé, dans les fermenteurs en situation distale, les
paramètres du milieu et les nutriments entrant sont plus constants. Des travaux
complémentaires sur d’autres espèces de mammifères herbivores permettraient de vérifier
cette hypothèse et d’améliorer nos connaissances sur l’évolution temporelle de ces
communautés. De plus, nos travaux démontrent qu’une perturbation nutritionnelle de
faible ampleur et maintenue dans le temps modifie légèrement les communautés
bactériennes. La réponse de la communauté bactérienne est rapide et les délais
d’ajustement de la communauté nécessaires pour aboutir à un nouvel état d’équilibre
semblent courts, suggérant une forte réactivité et une importante capacité d’adaptation.
Toutefois, une opération chirurgicale sur fermenteur anaérobie semble une perturbation
ponctuelle, de nature à dépasser le seuil de réversibilité du système. En perspective, il semble
important de mieux préciser le lien entre l’amplitude de la perturbation et la réponse des
communautés bactériennes en termes de résistance, de résilience, de temps d’adaptation et
d’inertie du système. Des modèles de perturbation d’amplitude plus forte permettraient
également de mettre en évidence des corrélations entre le microbiote et son biotope plus
marquées que celles obtenues dans ce travail.
D’un point de vue finalisé, l’utilisation des antibiotiques chez les animaux d’élevage
est de plus en plus réglementée. Cela nécessite la mise en place de nouvelles stratégies
alimentaires, notamment dans la filière cunicole puisqu’on observe chez les lapins une forte
mortalité causée par des pathologies digestives. Par ailleurs, dans la filière des bovins laitiers,
les systèmes intensifs sont de plus en plus fréquents et nécessitent des rations énergétiques à
base de glucides rapidement fermentescibles qui peuvent entrainer une acidification
pathologique du rumen (acidose). Nos travaux confirment que l’alimentation, et notamment la
teneur en fibres de la ration est une voie de modulation possible pour ces écosystèmes
matures. Toutefois, il pourrait être plus efficace d’orienter les communautés microbiennes au
cours de leur implantation dans le tractus digestif (après la naissance) pour améliorer la santé
digestive chez le lapin et l’efficacité digestive chez la vache. En effet, durant cette période, le
microbiote est particulièrement réceptif aux facteurs abiotiques. Cependant, si les modalités
309
Conclusions & Perspectives
de réorientation du microbiote au bénéfice de l’hôte restent à déterminer, la nutrition
constituerait probablement un levier de choix pour orienter le microbiote.
310
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Résumé
The aim of this work was to characterize the specific (Bos taurus vs Oryctolagus
cuniculus), individual, spatial (inter- and intra- digestive fermentors) and temporal (in
undisturbed or disturbed conditions) variability of the digestive ecosystems (prokaryotic
communities and biotope) in herbivorous mammals by comparing two animal models, cow
and rabbit, and by using molecular methods (CE-SSCP and qPCR). Concerning methodology,
we developed the StatFingerprints program to improve processing and statistical analysis of
CE-SSCP profiles and better extract ecological information they contained about structure and
diversity of communities. We also developed more specific (Firmicutes and Bacteroides
Prevotella) primers than those available. From a cognitive point of view, our work
demonstrated a strong effect of host species on ecosystem: communities presented a higher
richness (+8 %, +12 % for bacteria and Archaea, respectively), a greater diversity (+19 % for
bacteria) but are less abundant (-4.9 % bacteria) in cow rumen than in rabbit cæcum. The
rumen biotope is less acid (+0.6 pH unit), more reductive (-30 mV), and contains a lower
concentration of fatty acids (-19%) and a higher concentration of NH3-N (+39%) than cæcal
biotope. Taken together, these results suggested a determining role of the digestive
physiology of the host and of coevolution phenomena between the host and its microbiota.
Our results did not permit to evidence an individual effect on the procaryotic communities
suggesting that the genetic similarity between animals we used and/or the strong
standardization of breeding conditions (housing, food etc) tended to reduce the influence of
the individuals on their prokaryotic communities. We showed that the procaryotic
communities evolved along the digestive tract in relation to the physiology and the
environmental conditions of the various compartments in which they live. In addition, in the
rumen, we evidenced a variability of the bacterial community related to the fraction
considered, liquid or solid. Our data suggested that, both in basal and disturbed situations, the
bacterial communities of the two host species did not evolve in the same way in time. Indeed,
in the rumen of the cow and basal condition, the bacterial community fluctuated sporadically
suggesting a dynamic balance whereas it remains in a stable state in the cæcum of the rabbit.
The two communities reacted quickly (<2 days) and adapted quickly to an increased ratio
starch/fibres to reach a new balance, dynamic in the rumen and stable in the cæcum. On the
other hand, our work did not highlight important correlations between the bacterial
communities and the parameters of their environments. From a finalized point of view, these
data confirmed that the nutrition is a relevant way to try to reorientate the functioning of
digestive ecosystems in these two species, toward a better digestive health and/or efficiency.
Keyswords: cow, rabbit, CE-SSCP, qPCR, bacteria, Archaea, dynamic, disturbance, nutrition,
diversity, structure, ecology
359
Résumé
360
Résumé
L’objectif de ce travail était de caractériser la variabilité spécifique (Bos taurus vs
Oryctolagus cuniculus), individuelle, spatiale (inter- et intra- fermenteurs digestifs) et
temporelle (en conditions non perturbée ou perturbée) des écosystèmes digestifs des
mammifères herbivores (communautés procaryotiques et biotope) en comparant deux modèles
animaux, la vache et le lapin, et en utilisant des outils moléculaires (CE-SSCP et qPCR). D’un
point de vue méthodologique, nous avons développé un programme informatique,
StatFingerprints, pour améliorer le traitement et l’analyse statistique des profils CE-SSCP et
ainsi mieux extraire l’information écologique qu’ils contiennent en termes de structure et de
diversité des communautés. Nous avons également mis au point des systèmes de qPCR plus
spécifiques (Firmicutes et Bacteroides Prevotella) que ceux précédemment décrits. D’un
point de vue cognitif, nos travaux démontrent une forte influence de l’espèce hôte sur les
caractéristiques de son écosystème : les communautés sont plus riches (+8 %, +12 % pour les
bactéries et les Archaea, respectivement), plus diverse (+19 % pour les bactéries) mais moins
abondantes (-4.9 % de bactéries) dans le rumen de la vache que dans le cæcum du lapin. Le
biotope ruminal est moins acide (+0.6 unité pH), plus réducteur (-30 mV), et contient moins
d’acides gras volatils (-19%) et plus de NH3-N (+39%) que le biotope cæcal. Cela suggère un
rôle déterminant de la physiologie digestive de l’hôte et/ou des phénomènes de coévolution
hôte/microbiote. Nos travaux n’ont pas permis de mettre en évidence un effet de « l’individu
hôte » sur les caractéristiques de sa communauté microbienne suggérant que la proximité
génétique entre les individus (race) et/ou la forte standardisation des conditions d’élevage
(logement, alimentation etc.) tendent à uniformiser l’influence des individus sur le
déterminisme de leurs communautés procaryotiques. Nous avons montré qu’il existe une
évolution des communautés microbiennes le long du tractus digestif en relation avec la
physiologie et les conditions environnementales des différents compartiments à laquelle
s’additionne, dans le rumen, une variabilité liée à la fraction, liquide ou solide, considérée.
Nos données suggèrent qu’à l’état basal et en situation de perturbation, les communautés
procaryotiques des deux espèces hôtes n’évoluent pas de la même façon dans le temps. Ainsi,
dans le rumen de la vache, la communauté bactérienne fluctue de façon sporadique suggérant
un état d’équilibre dynamique alors qu’elle reste dans un état d’équilibre statique dans le
cæcum du lapin. Les deux communautés réagissent de façon rapide (<2jours) et s’adaptent
rapidement à une augmentation du ratio amidon/fibres pour atteindre un nouvel équilibre,
dynamique dans le rumen et statique dans le cæcum. En revanche, nos travaux n’ont pas mis
en évidence de corrélations importantes entre les communautés bactériennes et les paramètres
de leur environnement. D’un point de vue finalisé, ces données confirment que la nutrition est
une voie d’action pertinente pour essayer de réorienter le fonctionnement des écosystèmes
digestifs chez ces espèces d’intérêt zootechnique, vers une meilleure santé et/ou efficacité
digestive.
Mots clés : vache, lapin, CE-SSCP, qPCR, bactérie, Archaea, dynamique, perturbation,
nutrition, diversité, structure, écologie
361
Résumé
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Amilo Berkan